Un1Cas12f1 (Cas14a1)
产品描述
Un1Cas12f1(又名Cas14a1)是依赖于crRNA和tracrRNA共同介导的(或融合后的sgRNA单独介导的)DNA核酸内切酶，能特异结合并切割靶标ssDNA，且不受PAM位点的限制。此外，Un1Cas12f1也能以PAM依赖的方式特异地剪切靶标dsDNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。与其他Cas12蛋白类似，Un1Cas12f1蛋白同样拥有针对ssDNA的反式切割活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，双链或单链DNA靶标均能激活Un1Cas12f1的反式剪切活性，即当Un1Cas12f1蛋白与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。
相比于其他的Cas蛋白，Cas12f1蛋白的分子量普遍较小(400~700AA)，其中Un1Cas12f1的分子量约61.5 kD，可用于靶标核酸的分子检测(详细信息请参考PMID: 30337455)。
产品优势
✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内切割1 pmol ssDNA探针所需的Cas12f酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。
实验案例
1.1.Un1Cas12f1的反式剪切：本实验中使用3种ssDNA靶标序列，分别命名为Target ssDNA1，Target ssDNA2，Target ssDNA3，并针对不同靶标序列设计了对应的sgRNA。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当Un1Cas12f1在对应sgRNA引导下与特异靶标ssDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。
图1:不同ssDNA靶标存在下Un1Cas14a1反式剪切的结果。
Fig 1. Results of Un1Cas14a1 collateral cleavage in the presence of different target ssDNA.
实验流程
1.顺式切割实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 µM Un1Cas12f1 Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM Target DNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 µM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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◆ 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12b进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。
◆ 60℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
2.反式剪切实验
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组分 |
体积 |
终浓度 |
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10 × HOLMES Buffer 1 |
2 μL |
1 × |
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10 μM Un1Cas12f1 Nuclease |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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10 μM sgRNA |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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1 μM Target DNA |
0.5~5 μL |
25~250 nM |
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10 μM ssDNA Reporter |
0.05~0.5 μL |
25~250 nM |
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Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
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◆ 反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，AapCas12b Nuclease可用1×HOLMES Buffer1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），sgRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
◆ 反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告。
◆ 实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，60℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
产品组分
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组分 |
32119-01 (100 pmol) |
32119-03 (1,000 pmol) |
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● Un1Cas12f1 Nuclease (10 μM) a |
100 pmol |
1,000 pmol |
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● 10 × HOLMES Buffer 1 |
1 mL |
1 mL |
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● Control Target ssDNA and sgRNA (10 μM) b |
5 μL |
5 μL |
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● ssDNA Reporter (FAM-BHQ1, 10 μM) c |
5 μL |
5 μL |
a.Un1Cas12f1 Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target ssDNA and sgRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系；
c.ssDNA Reporter (FAM-BHQ1)应避光保存，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。
保存条件
Control Target ssDNA and sgRNA于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。
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