AsCas12a(又名AsCpf1)一种由crRNA单独引导的DNA核酸内切酶，来源于Acidaminococcus sp. BV3L6菌株。在靶标双链DNA存在PAM (TTTV，V=A/C/G)序列的情况下，AsCas12a可特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。而AsCas12a特异地剪切单链DNA靶标不依赖PAM序列。此外，双链或单链DNA靶标均能激活AsCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当AsCas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。因此，AsCas12a酶不仅可用于体外dsDNA的特异剪切，也可用于靶标核酸的快速检测，详见本公司开发的HOLMES[1]核酸快检技术。

✽ 标准化定义的反式剪切活性：在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12a酶量定义为1 transU。本公司提供的Cas酶transU数值可于COA检测报告中查询。

1.AsCas12a的顺式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标，靶标双链DNA总长度为825 bp，实验中设计的crRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明，AsCas12a在crRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列，导致靶标DNA双链断裂，得到2段顺式剪切产物，片段大小分别为525 bp和300 bp。

图1:AsCas12a的顺式剪切活性

2.AsCas12a的反式剪切：本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标dsDNA，实验中设计的crRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。同时，在剪切反应体系中加入ssDNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，当AsCas12a在crRNA引导下与特异靶标dsDNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssDNA的高效反式剪切活性，将体系中的ssDNA报告探针切碎，从而发出荧光信号。

图2:AsCas12a的反式剪切活性

1.顺式剪切实验

◆ 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12a进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。

37℃反应30 min~1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。

2. 反式剪切实验

反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。
反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，FnCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer 1稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。
反式剪切体系中探针的用量和预期反应到达平台期的时间可参考各批号Cas酶transU的具体数值，详见本公司提供的COA检测报告！

实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。

a.FnCas12a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL，100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；
b.Control Target DNA and crRNA应保存于-80℃并避免反复冻融，必须在6个月内使用，使用时建议取0.5 μL至每20 μL反应体系。

Control Target DNA and crRNA于-80℃储存，其余组分-20℃储存；≤ 0℃运输。