SpCas9
SpCas9是一种由crRNA和tracrRNA共同(或两者融合后形成的sgRNA)引导的DNA内切核酸酶,来源于S. pyogenes菌株。在靶标双链DNA存在PAM(5′-NGG-3′)的情况下,特异地剪切靶标双链DNA,使DNA双链断裂并生成平末端。PAM对于Cas9的识别和剪切都是必需的,其剪切位点位于目标序列(target sequence)内,离PAM区3个碱基。此外,在DNA PAMmer序列存在时,SpCas9也能特异地剪切单链DNA或RNA(详细信息请参考PMID: 24476820;PMID: 25274302)。此酶还可应用于体外靶标DNA的剪切、目的片段的克隆等实验(详细信息可参考PMID: 26323354) 。
产品优势
✽ 高纯度
✽ 高灵敏度
✽ 高特异性
实验案例
1.SpCas9的顺式剪切:本实验中使用小鼠来源的DNMT1基因的部分片段作为靶标,靶标双链DNA总长度为2.2 kb,实验中设计的sgRNA包含与DNMT1序列互补的spacer区。实验结果表明,SpCas9在sgRNA的引导下特异识别并剪切DNMT1序列,导致靶标DNA双链断裂,得到2段顺式剪切产物,片段大小分别为1.3 kb 和0.9 kb。
图1:SpCas9的顺式剪切活性
实验流程
1.顺式剪切实验
组分 |
体积 |
终浓度 |
10 × TOLO Buffer 3 |
2 μL |
1 × |
10 μM SpCas9 Nuclease |
0.5 μL |
250 nM |
10 μM sgRNA |
0.5 μL |
250 nM |
1 μM Target dsDNA |
0.5 μL |
25 nM |
Nuclease-free water |
Up to 20 μL |
|
◆ 若用核酸电泳来分析顺式剪切产物,对于20 μL顺式剪切应体系,推荐target DNA的使用量为100 ng~500 ng,且target DNA片段长度在300 bp~3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算,建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1,以尽量确保target DNA被剪切完全。
37℃反应30 min~1 h,85℃灭活5 min。核酸电泳分析顺式剪切产物。
产品组分
组分 |
32101-01 (100 pmol) |
32101-03 (1,000 pmol) |
![]() |
100 pmol | 1,000 pmol |
![]() |
1 mL | 1 mL |
![]() |
5 μL | 5 μL |
a. SpCas9 Nuclease 浓度为 10 μM,即 10 pmol/μL,100 pmol 规格的总体积为 10 μL,1,000 pmol 规格的总体积为 100 μL;
b. Control Target DNA and sgRNA 应保存于-80℃并避免反复冻融,必须在 6 个月内使用,使用时建议取 0.5 μL 至每 20 μL 反应体系。
保存条件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃储存,其余组分-20℃储存;≤ 0℃运输。
单位名称: |
详细地址:
南京市秦淮区光华路166号德兰大厦B座
|
qq:
1076801270
|
联系电话: |
Email: |