注：1 所有产品包装中均提供6×上样缓冲液。

  2 *标识制品中附带dNTP混合物

产品组分

P1021

Pfu DNA聚合酶  (5 U/μl )     50μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus）   1.25 ml

6×Loading Buffer           1 ml  

P1022

Pfu DNA聚合酶  (5 U/μl )        50 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus）       1.25 ml

dNTPs（各2.5 mM）           1 ml

6×Loading Buffer           1 ml 

P 1023

Pfu DNA聚合酶  (5 U/μl)           200 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus）         1.25 ml×2

6×Loading Buffer             1 ml

P 1024

Pfu DNA聚合酶(5 U/μl )             200 μl

10×Pfu Buffer（Mg²⁺ Plus）         1.25 ml×2

dNTPs（各2.5 mM）             1 ml×2

6×Loading Buffer             1 ml 

注： 10×Pfu Buffer分为Mg²⁺ Plus与Mg²⁺ Free两种包装，可方便选择。如没特别说明提供10×Pfu Buffer(Mg²⁺ Plus)。Mg²⁺ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl₂。

保存条件

-20℃保存2年。多次冻融不影响生物学活性。

产品说明

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb（简单模板）。延伸速度为0.2-0.4 kb/ min（70~75℃）。该酶具有5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性。扩增产物具有平末端。

产品特点

• 保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的10倍。
• 热稳定性好：95℃处理2小时后，酶活性为未经处理酶的95%。
• PCR产物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。

产品用途

• 高保真性PCR扩增
• 制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
• 平末端PCR克隆
• 位点特异性突变

活性定义

  一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

质量控制

  相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因；室温放置一周，

扩增活性无明显改变。

10×Pfu Buffer

  100 mM KCl

  200 mM Tris-Cl

  20 mM MgSO₄

  100 mM (NH₄)₂SO₄

酶贮存液

  20 mM Tris-HCl

  1 mM DTT

  0.1 mM EDTA

  100 mM KCl

  0.5 % TW 20

  0.5 % NP 40

  50 % Glycerol

应用举例

注：以下反应举例为50 μl标准PCR体系，仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物结构、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。

以λ DNA为模板，扩增1kb片段。

λ DNA（2.5 ng/μl）　　　　　　　　 1 μl

引物1（10 μM） 　　　　　　　　　   2 μl

引物2 （10 μM）　　　　　　　　　   2 μl

10×PCR Buffer   　　　　　　    5 μl

dNTPs（2.5 mM/L）           4 μl

Pfu DNA聚合酶（2.5 U/μl）         1 μl

超纯水       　　　　　     　补足至50 μl

PCR反应条件

95℃          3 min

95℃          30 sec

55~68℃     30 sec    30 Cycles

72℃           2 min

72℃           7 min

注意事项

1  Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端，可直接用于平末端连接。

2  dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

3  建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。

4  碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10^-6。

5   模板DNA推荐用量（50 μl PCR反应体系）

    人类基因组DNA       0.1 – 1 μg

    λDNA              0.5 – 5 ng

    质粒DNA          0.1 – 10 ng

    大肠杆菌DNA        10 – 100 ng

Q&A

问：Pfu DNA聚合酶的保真性为何高于Taq DNA聚合酶？

答：这是由于Pfu DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可在扩增的过程中，切掉错配的碱基，降低碱基错配率。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10^-5，而Pfu

DNA聚合酶的碱基错误率仅为1×10^-6。Pfu DNA聚合酶主要用于基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等对保真性有很高要求的实验。其扩增产物只具有

平末端，可直接用于平末端连接。要提高TA克隆效率，建议对PCR产物纯化后，加A再进行TA克隆，加A方法见**页。

问：Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段？

答：对于简单模板，可以扩增2 kb以下的片段。扩增长片段时，能否扩增成功主要与模板与引物的设计有关。为获得良好的扩增结果，建议引物长度大于18 bp，

Tm在55-80℃之间，浓度在0.1-0.5μM之间，略高于Taq。如需要很高的保真性，且又扩增较长片段时，建议选择Fusion pfu DNA聚合酶。

问：Pfu DNA聚合酶的扩增效率为何低于Taq DNA聚合酶？

答：这可能决定于Pfu DNA聚合酶本身的结构与特性。且具有核酸外切酶的活性，容易降解PCR引物。建议在配制PCR反应时，最后加入Pfu DNA聚合酶或使用

PfuMix。

问：使用Pfu DNA聚合酶扩增时，有没有必要在冰上配制PCR反应液？

答：有必要。建议在冰上配制PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性条带背景，获得良好的PCR结果。