活性氧检测试剂盒
产品简介：
Ø 活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit)是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-
DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使
探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧
的水平。
Ø 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture)，浓度为50mg/ml。
Ø 本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
Ø 本试剂盒可以测定100－500个样品。
包装清单：
DCFH-DA 10mM 0.1 ml
活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml) 1 ml
说明书 1 份
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
Ø 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
Ø 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
Ø 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 装载探针
对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细
胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-
DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的
DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分
接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺
激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2. 检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3. 参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用
FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
4. 其它说明
阳性对照可以按照1:1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟
内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内
观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时
DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
使用本产品的文献：
1. Jia SJ, Jiang DJ, Hu CP, Zhang XH, Deng HW, Li YJ.
Lysophosphatidylcholine-induced elevation of asymmetric dimethylarginine level by the NADPH oxidase pathway in endothelial cells.
Vascul Pharmacol. 2005 Nov 22; [Epub ahead of print] (Impact factor:2.547)
碧云天由在哈佛大学工作和学习的留学人员创办于2001年。20余年来专注于自主研发和生产。2007年成立上海碧云天生物技术有限公司，为国家级专精特新“小巨人”企业，并进一步入选第二批第一年建议支持的国家级专精特新“小巨人”企业，也是上海市科技小巨人企业、G60科创走廊一类重点扶持企业、上海市高新技术企业和上海市专精特新中小企业。江苏碧云天为江苏省高新技术企业，南通市双创优企。公司主要研发生产生物、医学研究用试剂、试剂盒、消耗品和仪器设备，同时提供生命科学研究的技术服务和一站式实验仪器设备采购平台。公司核心团队由来自美国哈佛大学、NIH、香港大学、中国科学院等国内外著名大学和科研机构的高水平科研人员及诺华、默克等顶尖医药企业的管理人员组成。2016年1人获国务院政府特殊津贴，2人入选“松江区优秀人才”；2019年1人入选国家百千万人才工程，1人入选上海市领军人才，6人获G60科创走廊优秀人才奖励，3人入选长三角G60科创走廊科技精英，3人入选上海市松江区拔尖人才培养计划。2019年碧云天荣获江苏省双创人才创业类第一名，2020年碧云天团队荣获江苏省双创团队创业类最高资助。2020年1人荣获上海市五四青年奖章，多人获G60科创走廊优秀人才奖励。2021年2人次入选国家级领军人才，2022年1人次入选国家级创新人才。截止2022年12月，已有累计超过150000篇注明使用碧云天产品的研究论文发表在包括Cell、Nature、Science等国际高水平学术期刊。Beyotime品牌年度文献引用率国内领先，并跻身全球20强。碧云天将继续致力于科研用技术和产品的研发，用我们最顶尖的技术、最成熟的产品、最热情的服务，服务生命科学，造福人民健康！
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