产品简介：

Ø Caspase 1 活性检测试剂盒(Caspase 1 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 1酶活性或纯化的Caspase 1酶活性的试剂盒。
Ø Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 1也称interkeukin 1b conberting enzyme(ICE)，有时被写作caspase-1或caspase1，是caspase家族中唯一可以剪切IL-1b前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟的细胞因子的caspase。Caspase 11可以剪切45kD的caspase 1前体蛋白， 产生20kD和10kD的片断，这两个片断可以形成异源二聚体(heterodimer)，并进一步由两个异源二聚体形成四聚体。Caspase 1可以通过剪切其凋亡Bcl-XL来调节细胞凋亡，并通过其对一些细胞因子前体的剪切来调控相关免疫反应。
Ø 本Caspase 1 活性检测试剂盒是基于caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA(acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 1的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
Ø 试剂盒中提供了caspase 1催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 1酶活性的标准品。
Ø 本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100微升的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测100个样品。





包装清单：

产品编号
产品名称
包装

C1102-1
裂解液
30ml

C1102-2
检测缓冲液
10ml/瓶，共2瓶

C1102-3
Ac-YVAD-pNA(2mM)
0.2ml/管，共5管

C1102-4
pNA(10mM)
1ml

—
说明书
1份






保存条件：

-20℃保存，Ac-YVAD-pNA和pNA需避光保存。



注意事项：

Ø 须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100微升的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。
Ø Ac-YVAD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
Ø 测定蛋白浓度需BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)，可向碧云天订购。
Ø pNA(中文名为4-硝基苯胺)有毒，请注意小心防护。
Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。



使用说明：


1. 准备工作：
A. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
B. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 测定pNA标准曲线：
A. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
B. 把试剂盒提供的pNA(10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
C. 每个浓度取100微升用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100微升的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
D. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。

3. 样品的收集：
A. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3D。
B. 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3D。
C. 对于组织样品：按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。
D. 4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟。
E. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
F. 立即测定caspase 1的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用BCA法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中含有10-30微克蛋白。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。
4. Caspase 1酶活性的检测：
A. 取出pNA和适量的Ac-YVAD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。
B. 如下设置反应体系：

空白对照
样品

检测缓冲液
90微升
80微升

待测样品
0微升
10微升

Ac-YVAD-pNA(2mM)
10微升
10微升

总体积
100微升
100微升


注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10微升 Ac-YVAD-pNA(2mM)。
C. 加入Ac-YVAD-pNA(2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
D. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 1催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
E. Caspase 1酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-YVAD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃可以剪切1nmol Ac-YVAD-pNA产生1nmol pNA的caspase 1的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 1。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 1酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
F. 用BCA法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的CHAPS，不适合采用Bradford法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 1的酶活力单位。

常见问题:
1. 测定出的A405过低：
A. 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。
B. 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。
C. 通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品的用量，最多可达40微升。
假设每次测定样品的用量为x微升，则：
C1.此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照x微升裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100微升的比例配制适量的标准品稀释液。例如样品用量为40微升，则按照40微升裂解液加入60微升检测缓冲液，即0.4毫升裂解液加入0.6毫升检测缓冲液的比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法同上面的使用说明所述。
C2.此时如下设置反应体系：

空白对照
样品

检测缓冲液
90微升
(90-x)微升

待测样品
0微升
x微升

Ac-YVAD-pNA(2mM)
10微升
10微升

总体积
100微升
100微升


说明：其中x不超过40，其余检测方法同上面的使用说明所述。