M-MLV两步法RT-PCR试剂盒
基本信息
产品名称：
M-MLV两步法RT-PCR试剂盒
英文名称：
M-MLV Two-Step RT-PCR System
国产/进口：
进口
产地/品牌：
M10531
型号：
现货库存
参考报价：
460
销售商：
总点击数：
2311
更新日期：
2011-07-14
产品类别：
性能参数
产品描述
有许多方法用于测量基因在组织和细胞中的表达量，包括Northern Blots、逆转录和PCR扩增（RT-PCR）、RNA酶保护分析、原位杂交、斑点印迹及核酸酶S1保护分析。在这些方法中，RT-PCR是最灵敏和最通用的方法。它能够用来确定转录物是否生成，评估表达水平，不需要构建和筛检出一个cDNA文库就可以克隆出cDNA产物。
两步法M-MLV RT-PCR系统是为从总RNA或mRNA中逆转录和PCR扩增得到特异目标RNA而设计的。这种1只管子2种酶的系统甚至可以为稀有RNA提供灵敏、快捷、可再现的分析。它采用M-MLV逆转录酶（Rnase H-,点突变）。
操作步骤
一、cDNA第一链合成
1. RNA变性
按照如下配比将各组分加入到已除酶的微量离心管中：
primer:
Oligo(dT)12-18 (10pmol)
or 25pmol randomprimers
or 10 pmole gene-specific primer (GSP) 1 μl
dNTP (10mM) 2 μl
RNase inhibitor (Rnasin) 1 μl
Nuclease-Free Water 11-x μl
RNA (1μg/μl) x μl
65℃5min，降温到4℃
2. 上述变性后退火反应液14ul中加入以下：
5 x Reaction Buffer 4 μl
M-MLV Revertase, Rnase H-, Point Mutant 1 μl
Total 20 μl
3. 混匀各组分并短暂温和离心；
4. （此步使用随机引物时必选）30℃ 温浴10min；
5. 接着42℃ 温浴30-60min；
6. 95℃ 温浴5min终止反应；（长片段77度15min）
7. 4℃ 放置5min。
建议：每50 μl PCR反应体积中使用2-4 μl第一链cDNA产物。
二、 PCR操作步骤
1. 在冰浴的管子中准备以下反应组分：
10x reaction buffer (Mg2+ plus) 5μl
primer: up steam 1μl
primer: down stream 1μl
10mM dNTP mix 1μl
The first strand cDNA template 2μl
Taq DNA Polymerase 0.6-0.8μl
DDW Water up to 50μl
2. 执行PCR程序
94°C 5min
94°C ,30s; 45-60°C, 45s; 72 °C, 1 min for 25-35 cycles
72°C, 10 min 4°C ,forever
注意：
1. 从Total RNA中预先分离出polyA RNA不是必须步骤，但如果这样做可以提高最终产物的产量和纯度。
2. RNA样品必须去除基因组DNA污染。
3. 以oligo(dT)18为引物的反应通常不要求优化，而使用随机引物的反应不同，随机引物与RNA的比率取决于反应中合成的cDNA的平均长度。随机引物/RNA的比率增加，将会增加短片段(~500 bp) cDNA的产量，反之，降低比率将增加长片段的产量。
4. 由高GC含量mRNA二级结构产生的问题，可以通过提高反应温度至45℃来改善，但由于M-MLV RT对热敏感，这样做也会相应降低酶的活性从而导致cDNA合成产量下降。
5. 若要分析反应产物cDNA，可以采用[32P]做放射性同位素示踪，方法如下：在预先加入M-MLV RT的反应混合物中添加10μCi [α-32P]dNTP (e.g., dATP)，用1 μl 0.5M EDTA终止反应并保持冰浴。
6. 合成的cDNA须保存在-20℃。
质量控制
试剂盒中所有组分均经过第一链cDNA合成反应检测，以多聚腺核苷酸RNA转录物作对照模板（含特异对照引物、oligo(dT)18和随机引物）。
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公司简介
上海美吉生物医药科技有限公司是上海美季生物技术有限公司旗下的一家面向市场提供多种分子生物学方面技术服务的高科技公司，座落在美丽的张江高科技园区。
2008年6月，美季公司顺应市场需求，成立了项目部，为客户提供从实验方案设计，实验过程执行，到后期数据分析等一系列的“全托管”式服务。内容包括454高通量测序，大片段全长鸟枪法测序，cDNA文库构建及EST测序，SNP检测，STRs分析，荧光定量PCR等。为了给客户提供更专业的服务，美季公司经过近一年的精心准备，于2009年2月成立了上海美吉生物医药科技有限公司专门为客户提供专业的项目服务。目前美吉公司拥有一支实力雄厚的技术队伍，有从事分子生物学研究十多年、经验丰富的技术骨干，也有锐意创新进取、拼劲十足的希望之星。我们秉承了美季生物“以客户为本，让客户满意”的服务宗旨，凭借先进的管理方法和标准化的工作流程，为您提供准确、快速、周到的技术服务！
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