MM MRD流式抗体

MM-MRD瓶是一种冻干产品。仔细阅读下面的说明
调整:
冻干多发性骨髓瘤最小残留病(MM-MRD)板保留了抗体预混合组合的稳定性。用蒸馏水将每个装有预混合混合物的冻干小瓶重新组合如下:
•管1:180µl蒸馏水。
•管2表面染色:120µl蒸馏水。
•管2胞质染色:70µl蒸馏水。
混合均匀，让溶液至少30分钟。
未使用的卷的再生瓶是稳定在4周的日期调整如果是存储在黑暗中在2 - 8ºC。
 
预期用途
MM-MRD panel是一种预先混合的6色抗体组合，用于精确识别和鉴别治疗MM患者骨髓样本中的恶性和正常浆细胞(PCs)。
本试剂必须经流式细胞仪检测合格方可使用。
 
程序原则
流式细胞术是在单个细胞的基础上同时分析不同细胞特征的一项创新技术。这是通过细胞的水动力聚焦来实现的，这些细胞通过一个接一个排列，并被激光束照亮。细胞之间的交互与激光束产生信号的两个不同的类型:那些由分散的光(向前散射(FSC) /侧散射(SSC)),主要反映了细胞的大小和其内部的复杂性,和那些与荧光染料的发射的光出现在/细胞。这些信号变成电脉冲，电脉冲被放大并登记为数字信号，由计算机处理。当试剂被添加到样品中时，试剂中含有的荧光标记抗体的混合物会与它们所针对的抗原特异性结合，从而允许流式细胞术检测不同的细胞亚群。利用红细胞裂解液在细胞仪上采集标本，消除了可能阻碍检测目标人群的红细胞群
 
总结和解释
一般来说,独立的病理,MRD是定义的存在,在低频段,残余的肿瘤细胞治疗后(1)。在特殊情况下的MM,研究表明存在0,01%异常浆细胞(认为,目前,MRD阳性病例)与一个贫穷的结果(1)最近的调查关于当前实践MM-MRD通过流式细胞仪检测显示伟大的异质性的方法:抗体面板、识别策略及获得事件数(2)
 
2008年欧洲骨髓瘤网络报告(3)和最近发表的文献(4,5)将CD38、CD138和CD45分析与CD19、CD56、CD27、CD81和CD117相结合，作为MM中MRD检测的最佳方法的共识。
 
也证实,细胞质卡帕(κ)/λ轻链(λ)染色可能有助于阐明非典型发现罕见的疾病亚型。这一共识在两种EuroFlow MM-MRD多色流式细胞术联合中得到了翻译和改进。
 
immunophenotypic表征不使用同形像控制,主要因为有内部控制其他白细胞的数量来定义正面和负面的限制(总是应用仪器校准的标准操作程序时,你会发现一个完整的指南网站www.EuroFlow.org)。
 
采用标准化的MM-MRD检测方法，无论是样品制备还是鉴别策略，都可以将流式细胞术分析转化为一种快速、可靠、重现性好、经济有效、最重要的是灵敏度高的检测方法。
 
MM-MRD试剂盒经过精心设计，可通过流式细胞术特异性识别以下抗原CD38、CD45、CD56、CD19、CD81、CD117、胞质IgKappa和IgLambda。用于克隆性评价的轻链是多克隆的。多克隆替代单克隆抗体用于检测细胞内免疫球蛋白轻链在PCs克隆性评价中的优势(6)
 
试剂成分
材料包括
MM-MRD试剂盒提供两种不同的6色组合，包含足够的容量进行20个测试，包括:
固定剂游离氯化铵红细胞溶解液(BulkLysisTM)。
固定和渗透溶液(Fix&Perm®，nordici - mubio BV，荷兰)，用于细胞质检测免疫球蛋白轻链Kappa/Lambda，足以进行20次检测。
试剂为特定的串联补偿后准备使用在液体格式满足5测试(5µl /测试):
•CD45-PerCP-Cyanine 5.5
•CD19-PE-Cyanine7
•CD81-APC-C750
•Lambda APC-C750
 
管1含有以下用于表面染色的冻干抗体混合物(4瓶，每瓶5次):
•抗人CD38-FITC抗体，多表位。
•抗人CD56-PE抗体，克隆:C5.9，亚型:IgG2b。
•抗人cd45 -百分位-蓝嘌呤5.5抗体，克隆:EO1，亚型:IgG2b。
•抗人cd19 - pe -氰化物7抗体，克隆:19-1/，同型:IgG1。
•抗人CD117-APC抗体，克隆:104D2，亚型:IgG1。
•抗人CD81-APC-C750抗体，克隆:M38，亚型:IgG1。
 
管2由:
•用于表面染色的冻干抗体混合物(4瓶，每瓶5次):
抗人CD38-FITC抗体，多表位。
抗人CD56-PE抗体，克隆:C5.9，同型:IgG2b。
抗人cd45 -百分位-蓝嘌呤5.5抗体，克隆:EO1，同型:IgG2b。
抗人cd19 - pe -氰化物7抗体，克隆:19-1/，同型:IgG1。
•用于细胞质染色的冻干抗体混合物(4瓶，每瓶5次):
反CyIgκ-APC山羊抗体,克隆:多克隆。
反CyIgλ-APC-C750山羊抗体,克隆:多克隆。
 
 
各组分均含氮化钠(NaN3)≤0.09% (m/v)。试剂并不被认为是无菌的。
所需材料，但不包括在内
•3台激光流式细胞仪(8种颜色)及相应的计算机软硬件。
• Anti-human CD27 下降 和 CD138 抗体 必须 添加 (EuroFlowTM recommendationCD27 BV510 和 CD138 BV421). 
•用于流式细胞仪中获取样本的试管。通常是底部为圆形的管子
对于6ml，使用12x75毫米。
•自动吸管和喷嘴
•50毫升
•天文钟
•旋涡混合器
•离心机
•Lysing解决方案包含一个固定代理
•缓冲区:phosphate•Washing盐水buffered (PBS) containing≤0 . 09% (m / v)钠azide和牛肉serum albumin (BSA) 0.5% (m / v)
 
储存条件
试剂稳定,直到标签上显示的截止日期,当储存在2 - 8ºc试剂不应该被冻结或暴露在直射光在孵化期间存储或样本。将所有试剂瓶放在干燥处。一旦打开，小瓶必须储存在一个垂直的位置，以避免任何可能的溢出。
过程
准备
样品必须用商用抗凝血处理管收集(建议使用EDTA) (8,9)
1. 确定的绝对计数白细胞每µl样品处理。
2. 将每个MRD管中至少10 x 106个有核细胞的样本转移到50 ml管中染色(考虑到在松解过程中一些细胞无选择性丢失)。每50毫升溶出液不可使用超过2毫升的样本。如果需要处理的样本量较大(即细胞初始浓度较低)，则使用几根50毫升的试管。
3.用bulk裂解™(CYT- BL)(在蒸馏水中稀释至1X，室温‐RT)将试管充满至50ml体积。
4. 混合均匀，在滚轮或样品搅拌器中孵育15分钟。
5. 以800克离心10分钟，用巴斯德吸管或真空系统去除上清液，不干扰细胞颗粒。通常,300μl细胞悬液应该保持在管。
6. 加入2 ml PBS + 0,09% (m/v)的NaN3 + 0, 5% (m/v)的BSA，大力复苏细胞。
7. 用PBS + 0.09% (m/v)的NaN3+ 0.5% (m/v)的BSA完成含有细胞悬液的试管的体积，最终体积可达50ml。
8. 拌匀。
9. 800克离心5分钟，用巴斯德吸管或真空系统去除上清液，不干扰细胞颗粒。
10. 用2 ml PBS + 0.09% (m/v)的NaN3 + 0.5% (m/v)的BSA重悬细胞球。混合均匀后，将本品倒入5毫升的FACS管中。
11. 再用2毫升PBS + 0.09% (m/v)的NaN3 + 0.5% (m/v)的BSA溶液清洗50毫升法尔康试管，以恢复原试管中可能残留的细胞。将此体积添加到包含步骤10中传输的其余样品的5ml试管中。
12. 540g离心5分钟，将上清液倒出或用巴斯德吸管取出。如果剩下的细胞体积小于300μl PBS + 0, 09% (m / v) NaN3 + 0, 5% BSA (m / v)将被添加到达到至少300μl的体积。
13. 如果使用多个50毫升的试管(因为需要溶解大量的样品)，此时应将同一样品的细胞悬液混合，然后再调整细胞浓度。尽量保持最后的体积较低，以便在细胞浓度需要调整的情况下，如下一步所示，它可以很容易地做到稀释与推荐的缓冲液。
14. 最后调整细胞浓度为1×105细胞/µl resuspending颗粒与PBS + 0, 09% (m / v) NaN3 + 0, 5% BSA (m / v)。
15. 调整音量为了获得100µl包含10 x106细胞悬液细胞每管彩色/。
 
只对表面膜标记物染色步骤(MM-MRD管1):
重建的冻干瓶使用180µl蒸馏水,拌匀,让解决方案至少30分钟。
添加30µl抗体混合物和适当的体积CD27和CD138(不包括在混合物)。然后添加单元格
悬挂(10 x 106细胞每管)。
拌匀。
最佳染色条件下,如果需要,直到最终成交量为200µl PBS。
室温下避光孵育30分钟。
加入2毫升固定溶出液。
拌匀。
室温下避光孵育10分钟。
540g离心5min。
丢弃的上层清液用巴斯德吸管或真空系统没有扰乱细胞颗粒,造成大约100µl在每个管残余体积。
将2ml PBS+ 0.5% (m/v) BSA + 0.09% (m/v) NaN3加入细胞微球中。拌匀。
540g离心5min。
丢弃的上层清液用巴斯德吸管或真空系统没有扰乱细胞颗粒,造成大约100µl在每个管残余体积。
500年Resuspend细胞颗粒μl PBS + 0, 5% (m / v) BSA(没有NaN3)。
染色后立即采集细胞，或(如未立即采集)4℃保存(最长保存1h)，直至流式细胞仪检测。
在介质流速下采集样品。
 
表面膜与细胞质标记物联合染色步骤(MM-MRD管2):
重建的冻干瓶表面染色使用120µl蒸馏水,拌匀,让解决方案至少30分钟。
添加20µl的抗体混合管和适当的体积CD27和CD138(不包括在混合物)。然后加入细胞悬液(每管10×106个细胞)。
拌匀。
如果需要,添加PBS为了获得最终的染色200µl的体积。
室温下避光孵育30分钟。
将2ml PBS + 0.5% (m/v) BSA + 0.09% (m/v) NaN3加入细胞微球中。
拌匀。
540g离心5min。
使用巴斯德吸管或真空系统在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液，大致留下
在每个管100µl残余体积。
轻轻混合使细胞颗粒复苏。
添加100µl试剂(固定剂;Fix&Perm®，Nordic-MUBio BV，荷兰)混合均匀。
室温下避光孵育15分钟。
将2ml PBS + 0.5% (m/v) BSA + 0.09% (m/v) NaN3加入细胞微球中。
拌匀。
540g离心5min。
使用巴斯德吸管或真空系统在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液，大致留下
在每个管100µl残余体积。
通过彻底混合使细胞颗粒复苏。
添加100µl试剂B (permeabilizing解决方案;Fix&Perm®，Nordic-MUBio BV，荷兰)。
拌匀。
重建的冻干瓶细胞质染色使用70µl蒸馏水。
加10µl的抗体混合管包含200µl试剂B +细胞悬液。
拌匀。
室温下避光孵育15分钟。
将2ml PBS + 0.5% (m/v) BSA + 0.09% (m/v) NaN3加入细胞微球中。
拌匀。
540g离心5min。
丢弃的上层清液用巴斯德吸管或真空系统没有扰乱细胞颗粒,造成大约100µl在每个管残余体积。
Resuspend细胞颗粒500µl PBS + 0, 5% (m / v) BSA(没有NaN3)。
染色后立即采集细胞，或(如未立即采集)4℃保存(最长保存1h)，直至流式细胞仪检测。
以中等流量完全获得管道。
 
重要的建议
为了达到最佳结果，需要遵循EuroFlow标准操作规程进行细胞仪设置(10)
您将在www.EuroFlow.org网站上找到完整的指南(细胞仪安装SOP)，其中包括建议
用于FSC、SSC和目标电压PMT设置、补偿设置和仪器性能监控。
 
流式细胞术分析
Cytognos推荐使用分析软件InfinicytTM(11)，它为流式细胞术数据的数据集成和多维分析提供了一种革命性的方法。其创新性的特点使分析和解释结果更容易、更快、更准确。Infinicyt™包含专用工具，可以更好地识别和识别
不同细胞群的描述。它是EuroFlow™项目“流式细胞术用于血液恶性肿瘤的快速、灵敏诊断和随访”的一部分，高水平的流式细胞术专业人员参与其中。Infinicyt™包括各种各样的分析工具和专用的图形，允许使用引用进行分析
图片，或计算新的虚拟参数。您将在www.infinicyt.com网站上找到关于InfinicytTM的完整信息。
1. 加载浆细胞MM-MRD剖面。
2. 加载分析策略
3.检查PC人群/s，确保其CD38、CD138阳性高表达，CD45表达由dim至阴性。在需要的时候，根据每个案例的映像移动分析门。
4. 分配PC人口。
5. 从配置文件加载普通PC参考图像。
6. 根据CD19和CD56表达对PC人群进行分类。
7. 检查每四个PC子种群的kappa/lambda比值。
8. 检查恶性PC中CD27(低至阴性异常表达)、CD117(阳性异常表达)、CD81(完全阴性异常表达)的异常表达。
 
文献
1. Andy C. Rawstron, J. Anthony Child, Ruth M. de Tute, Faith E. Davies, Walter M. Gregory, Sue E. Bell, Alexander
J. Szubert, Nuria Navarro-Coy, Mark T. Drayson, Sylvia Feyler, Fiona M. Ross, Gordon Cook, Graham H. Jackson,
Gareth J. Morgan, and Roger G. Owen. Minimal Residual Disease Assessed by Multiparameter Flow Cytometry in
Multiple Myeloma: Impact on Outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J of Clinical Oncology.
31(20): 2540-2547 (2013).
2. Mark Roschewski, Maryalice Stetler-Stevenson, Constance Yuan, Sham Mailankody, Neha Korde, and Ola
Landgren. Minimal Residual Disease: What Are the Minimum Requirements? J of Clinical Oncology. 32(5): 475-476
(2014).
3. Andy C. Rawstron et al. Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple
myeloma and related disorders. Haematologica 93(3): 431-438 (2008).
4. Stetler-Stevenson M, Paiva B, Stoolman L, Lin P, Jorgensen JL, Orfao A, Van Dongen J, Rawstron AC. Consensus
guidelines for myeloma minimal residual disease sample staining and data acquisition. Cytometry B Clin Cytom.
(2015 Apr 23) doi: 10.1002/cyto.b.21249.
5. Arroz M, Came N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, Monreal M, de Tute R, Vergilio JA, Rawstron AC, Paiva B.
Consensus guidelines on plasma cell myeloma minimal residual disease analysis and reporting. Cytometry B Clin
Cytom. (2015 Jan 23) doi: 10.1002/cyto.b.21228.
6. Jeroen F. van Velzen, Dorine van den Blink, and Andries C. Bloem. Inability of a Monoclonal Anti-Light Chain
Antibody to Detect Clonal Plasma Cells in a Patient with Multiple Myeloma by Multicolor Flow Cytometry. Cytometry
B Clin Cytom. 84(1): 30-32 (2013).
7. Protection of Laboratory Workers from occupationally acquired infections. Second edition; approved guideline
(2001). Villanova PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document M29-A2.
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