引言
肌醇是一种环糖醇,存在于大多数真核细胞中,同时也是 1,2,3,4,5,6 - 环己六醇的优势异构体。作为真核细胞信号传导的关键组分,肌醇会以肌醇(多)磷酸盐和磷脂酰肌醇的形式,发挥重要第二信使的作用。
肌醇在自然界中含量丰富,是动植物生长所必需的化合物。枯草芽孢杆菌等多种微生物均具备分解代谢途径,能够将肌醇作为唯一碳源加以利用。
在植物体内,肌醇主要以植酸(即肌醇六磷酸)的形式存在。植酸是植物种子中磷的主要储存形式,约占总磷含量的 70%。
谷物中植酸的大量存在是食品与动物饲料行业关注的重点问题。单胃动物因缺乏内源植酸酶,无法利用这种形式的磷。
本方法(K-INOSL 试剂盒法)适用于食品、乳制品及其他物料中肌醇的特异性检测。但该试剂盒不适用于婴幼儿配方食品中肌醇的测定。
对于游离肌醇含量极低的样品,其植酸含量也可借助 K-INOSL 试剂盒进行测定。具体操作方式为,通过植酸酶和碱性磷酸酶对植酸进行完全脱磷酸化处理,再测定反应过程中释放的肌醇含量,即可计算出样品中的植酸含量。该方法需搭配美格酶植酸 / 总磷检测试剂盒(K-PHYT)共同使用。
原理
在肌醇脱氢酶(IDH)的作用下,肌醇可被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)氧化,生成 2,4,6/3,5 - 五羟基环己酮、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和氢离子(H⁺),反应式如下(1)。
(肌醇脱氢酶催化)
(1)肌醇 + NAD⁺→ 2,4,6/3,5 - 五羟基环己酮 + NADH + H⁺
该反应还需依赖黄递酶催化的第二步反应。在此过程中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)可将碘硝基氯化四氮唑(INT)还原为碘硝基四氮唑甲臜(INT-formazan),进而实现肌醇的快速定量转化,反应式如下(2)。
(黄递酶催化)
(2)INT + NADH+ H⁺→ NAD⁺ + 碘硝基四氮唑甲臜(INT-formazan)
该反应生成的碘硝基四氮唑甲臜(INT-formazan)的量与肌醇的量呈化学计量关系。
可通过测定 492 nm 波长下的吸光度增加值,对碘硝基四氮唑甲臜进行定量。
特异性、灵敏度、线性关系与精密度
本反应生成的碘硝基四氮唑甲臜(INT-formazan)的量与肌醇的量呈化学计量关系。
可通过在 492 nm 波长下测定吸光度的增加值,对碘硝基四氮唑甲臜进行定量。
该检测方法可快速转化肌醇,同时也能转化 D - 葡萄糖和 D - 木糖。
但 D - 葡萄糖会在检测过程中被己糖激酶磷酸化,生成不参与反应的 D-6 - 磷酸葡萄糖。
本检测方法的最小可分辨吸光度值为 0.010 吸光度单位。这对应着样品溶液中肌醇浓度为 0.41 mg/L,测定时所用样品体积为最大体积 0.5 mL。
该检测的检出限为 0.82 mg/L,由 0.5 mL 最大样品体积下 0.020 的吸光度差值计算得出。
在每孔肌醇含量为 2~35 μg 的范围内,本检测方法具有良好的线性关系。对同一份样品溶液进行平行双样测定时,吸光度差值波动范围为 0.005~0.010。
若样品制备浓度为 10 g/L,对应的肌醇含量差异范围为 0.02~0.05 g/100 g。
干扰因素:
如果肌醇的转化在测定中规定的时间内(约10分钟)完成,通常可以得出结论,没有发生干扰。然而,这可以通过在反应完成时向试管中加入肌醇(约25µg,0.1 mL)来进一步检查。应观察到吸光度显著增加。
通过加入内标,可以识别被分析样品中的干扰物质。预计该标准的定量回收。通过进行回收实验,即在初始提取步骤中向样品中添加肌醇,确定样品处理和提取的损失。
高浓度的L-抗坏血酸、半胱氨酸或亚硫酸盐会干扰测定,因为它们会与INT反应,导致非酶“蠕变”率。这些化合物应通过用H2O2和碱处理样品来去除,如下所示:
称取或移取样品,必要时稀释,放入50 mL容量瓶中。加水至约40 mL,然后加入1 mL 2 M KOH和0.01 mL H2O2(30%v/v)。将溶液在约70°C下孵育10分钟。冷却至20-25°C,用1 M H2SO4调节pH至8.0。用蒸馏水填充至标记处,混合、过滤并使用溶液进行测定。
套件:
Megazyme提供适用于进行50次检测的试剂盒。试剂盒包含:
瓶1:缓冲液(5.5 mL,pH 7.4)加叠氮化钠(0.02%w/v)作为防腐剂。在4°C下稳定2年以上。
瓶2:ATP。冻干粉。在-10°C以下稳定5年以上。
瓶3:己糖激酶悬浮液(1.1 mL)。在4°C下稳定2年以上。
瓶4:缓冲液(53 mL,pH 9.5)加叠氮化钠(0.02%)w/v)作为防腐剂。在4°C下稳定2年以上。
瓶5:(x2)NAD++INT。冻干粉。在-10°C以下稳定5年以上。
瓶6:Diaphorase悬浮液(1.1 mL)。在4°C下稳定2年以上。
瓶7:肌醇脱氢酶悬浮液(1.1 mL)。在4°C下稳定2年以上。
瓶8:肌醇标准溶液(5 mL,0.25 mg/mL)在0.02%(w/v)叠氮化钠中。在4°C下稳定2年以上。
概要:
规格:每个试剂盒50次测定
运输温度:环境温度
储存温度:短期稳定性:2-8°C,
长期稳定性:见瓶身
稳定性:在推荐的储存条件下>2年
分析物:肌醇
检测形式:分光光度计
检测方法:吸光度
波长(nm):492
信号响应:增加
线性范围:每次测定2至35µg肌醇
检测限:0.8 mg/L
反应时间(分钟):~30分钟
应用示例:动物饲料、食品和其他材料。
方法认可:新方法
若将所有样本体积减半,每套试剂的实验次数可翻倍。此操作可轻松通过MegaQuantTM Wave分光光度计(D-MQWAVE)实现。
详见》http://equl.cn/goods.php?id=162