HYGROMYCIN B--1000 UNIT POWDER

潮霉素B（Hygromycin B），从吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）分离到的一种氨基糖苷类抗生素。通过与30S核糖体亚基结合，诱导对mRNA模板的错读且抑制易位，从而以阻止蛋白合成。潮霉素B能杀死细菌、真菌和高等真核细胞。主要用来筛选和维持培养稳定转染Hph载体的原核细胞或真核细胞（植物细胞和哺乳动物细胞）。

对潮霉素B（Hygromycin B）的抗性来源于大肠杆菌潮霉素抗性基因（hph或hyg），该基因能编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase），使得潮霉素B发生磷酸化从而失去活性。目前Hph抗性基因主要有两种来源，最初来源是大肠杆菌（Escherichia coli），另一来源是潮霉素B产生菌吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）。如今，携带Hph抗性的载体大多来自大肠杆菌。

我司提供两种产品形式的潮霉素B。
 

产品特性

1）化学名：O-6-Amino-6-deoxy-L-glycero-D-galacto-heptopyranosylidene-(1-2-3)-O-β-D-talopyranosyl(1-5)- 2-deoxy-N3-methyl-D-streptamine

2）同义名：Hygromycin B, from Streptomyces hygroscopicus 潮霉素质B，来源于吸水链霉菌

3）CAS NO：31282-04-9

4）分子式：C20H37N3O13

5）分子量：527.53g/mol

6）  外观：类白色至白色粉末

7）纯度：≥90%（HPLC）

8）效价：≥1050 U/mg

9）化学结构：

保存与运输方法

保存：粉末-20℃干燥保存，2年有效。溶液2-8°C避光保存，1年有效。

运输：冰袋运输。

使用方法

1. 储存液制备

1）潮霉素B（粉末形式）：称取适量粉末溶于1×PBS配制成50mg/ml溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，置于2-8°C避光保存。

2）潮霉素B（溶液形式）：已是无菌储存液，直接用细胞培养液稀释到工作浓度即可使用。

2. 建议工作浓度

潮霉素B用来筛选稳定转染细胞株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化。

1）哺乳动物细胞使用浓度为50-1000 μg/ml，常用筛选浓度为200 μg/ml，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。

2）植物细胞常用浓度：20-200 μg/ml；

3）细菌常用浓度：20-200 μg/ml；

4）真菌常用浓度：200-1000 μg/ml；

3. 杀灭曲线的建立

建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），至少设立5个浓度，筛选到适合自身实验体系的最佳浓度。

1）将未转化细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃培养过夜；【注意】：对于需要更高密度以保证活力的细胞，增加接种量。

2）第二日，用含梯度浓度潮霉素B的培养基替换旧培养基。比如，哺乳动物细胞常用浓度为50-1000μg/ml，可设50, 100, 250, 500, 750, 1000μg/m这6个浓度，各3个平行。同时设置一阴性对照，3个平行。

3）接下来每3-4日更换新鲜的含抗生素培养基。

4）按照固定周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转化细胞生长的恰当浓度。选择在理想天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选所需的工作浓度。

4、稳转细胞的筛选

1）转染48h后，用含最佳筛选浓度潮霉素B的培养基进行细胞传代。【注意】：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。当细胞密度过高，筛选效率会降低。为了得到较好的筛选效果，建议将细胞稀释至丰度不超过25%。

2）每3-4日更换新鲜的含抗生素培养基。

3）筛选7天后观察并评估细胞集落的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这些取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。

4）挑取5-10个抗性克隆到35mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

5）之后换用正常培养基培养即可。