基因定点突变试剂盒

产品简介：

Ø 碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或
多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。

Ø 本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。
只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于DpnI的模板质粒的消化，
转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考
图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
Ø 参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补
的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为
模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变
位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒
通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通
过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可
以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的
质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质
粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期
的突变质粒了。
Ø 本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可以用于感受态细菌的制备。
Ø 本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。 图1. 基因定点突变试剂盒原理图



包装清单：

Pfu DNA Polymerase 10 微升
Reaction Buffer (10X) 100 微升
dNTP Mix (2.5mM each) 50 微升
Dpn I 10 微升
DH5α甘油菌 200 微升
Nuclease-Free Water 1 毫升
说明书 1 份




保存条件：

-20℃保存，一年有效。



注意事项：

Ø 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。


Ø 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。


Ø 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


使用说明：

1.
引物设计：


用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
(1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必须满足4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的

二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。

例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则

左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ＝4X8＋2X8＝48≥45
(4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制：

如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100μM
的溶液，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中，
再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择：

选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的
基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右
的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的
一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必须使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高
GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必须使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam+
的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应：

(1) 如下设置基因定点突变反应体系：
Nuclease-Free Water ?微升
Reaction Buffer(10X) 5微升
引物(10μM each) 2微升
dNTP Mix(2.5mM each) 4微升
待突变模板质粒(0.5μg) ?微升
总体积 49微升

按照上述顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，
使总体积为49微升。适当混匀后，加入1微升Pfu DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿
物油(mineral oil)以防止蒸发。
(2) 按照如下参数设置PCR仪：
步骤 循环数 温度 时间 说明
1 1 95℃ 1分钟 最初变性
2 18 95℃ 40秒 变性
60℃ 1分钟 退火
68℃ 1分钟/kb 延伸
3 1 72℃ 10分钟 延伸、补全
4 1 4℃ 长时间保持 暂时存放

说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。
5. Dpn I消化：
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中

进行。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定：
感受态细菌的转化效率必须至少在107以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突

变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操
作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通
常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。

取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突
变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

常见问题：

请参考本试剂盒的说明书。




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