货号：T1211
储存条件：-20℃
产品组成：

组分	规格 S	规格 M	规格 L
2× Lab SuperHF PCR Master Mix	1 ml	5×1 ml	20×1 ml
2.5× PCR Enhancer	1 ml	1 ml	5×1 ml

产品简介：
2× Lab SuperHF PCR Master Mix是即用型2×预混合溶液，包含Lab Super High-Fidelity DNA Polymerase、dNTPs 和精心优化的反应缓冲液，只需加入模板、引物和水即可进行高保真PCR反应。本产品适用于以基因组DNA、cDNA、质粒以及粗品为模板的PCR反应。
 
产品特点：
1. 保真度高，扩增速度快：保真度是普通Taq酶的70倍，扩增速度是Pfu的5倍。
2. 扩增片段长度长：使用λDNA、质粒等简单模板时，可以轻松扩增长达20 kb的片段；而使用基因组DNA等复杂模板时，能有效扩增长达12 kb的片段。
3. 2× Lab SuperHF PCR Master Mix对PCR抑制剂具有良好的耐受能力，对粗提样本也能进行很好的扩增。
 
反应体系：                     模板用量：

试剂	使用量
2× Lab SuperHF PCR Master Mix	25 μl
2.5× PCR Enhancer（可选）	20 μla
上游引物 (10 μM)	1 μl
下游引物 (10 μM)	1 μl
模板	x μl
ddH2O	Up to 50 μl

 

模板种类	推荐用量
基因组DNA	10~200 ng
质粒或病毒DNA	10 pg~50 ng
cDNA	1~5 μl (不超过PCR反应总体积的1/10)
粗品	1~5 μl (不超过PCR反应总体积的1/10)

a. 当扩增片段 GC 含量 >60% 且优化条件也无法正常扩增时，推荐使用 2.5×PCR Enhancer来优化 PCR 反应。程序推荐：Touchdown PCR（降落 PCR）程序。
反应程序：

①三步法：

步骤	温度	时间	循环数
预变性b	95oC	3-5 min	1
变性	95oC	10 s	30-35
退火c	55~72oC	15s
延伸d	72oC	30 s/ kb
终延伸	72oC	5 min	1
	4-8oC	Hold

 
b. 对于普通模板，预变性可缩短至30~60 s；对于复杂模板，例如高 GC 序列，推荐延长预变性时间到3~5 min 以充分变性；
c. 根据引物 Tm 值设置退火温度。如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)。如果需要，可以建立一个温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度;
d. 对于大多数模板，30s/kb即可有效扩增; 对于一些复杂模板，可延长延伸时间至30~60 s/kb。

②两步法e：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95oC	3-5 min	1
变性	95oC	10 s	30-35
退火&延伸	65~68oC	30 s/ kb
终延伸	72oC	5 min	1
	4-8oC	Hold

 e. 通常情况下使用两步法和三步法进行 PCR 扩增，性能无显著差异，可以根据操作习惯自行选择。但对于一些复杂模板(如长片段，Tm 分布不均匀，特殊结构模板)，可以尝试两步法或Touchdown PCR(降落PCR)法。此外，使用质粒为模板进行点突变时，也建议使用两步法。

③Touchdown PCR（降落 PCR）f法：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95oC	3-5 min	1
变性	95oC	10 s	30-40
退火	68℃ (-0.2℃/cycle)	15s
延伸	72oC	30 s/ kb
终延伸	72oC	5 min	1
	4-8oC	Hold

 f. 该程序仅供参考，Touchdown PCR (降落PCR)有多种程序可灵活调整，请根据实验需求与习惯自行决定是否采用。
 
注意事项：
1. 请不要使用含尿嘧啶的引物和模板。
2. Lab Super High-Fidelity DNA Polymerase具有较强的校正活性，产生的扩增产物是平末端，如果用于下一步克隆实验，建议使用平末端克隆。如果扩增产物需要用于TA克隆，加A之前须先进行DNA纯化。
3. 为了提高扩增成功率和产量，请使用高质量的模板。
 
常见问题：

问题描述	可能原因	解决办法
无产物或产物量少	引物	优化引物设计
	退火温度	设置退火温度梯度，找到合适的退火温度
	引物浓度	适当提高引物浓度
	延伸时间	适当增加延伸时间至 30~60 s/kb
	循环数	增加循环数至 36~40 个循环
	模板纯度	使用高纯度模板
	模板使用量	使用量参照反应体系推荐量调整并适当增加
有杂带或弥散条带	引物	优化引物设计
	退火温度	尝试提高退火温度并设置退火温度梯度
	引物浓度	适当降低引物浓度
	循环数	减少循环数至 25~30 个循环
	模板纯度	使用高纯度模板
	模板使用量	使用量参照反应体系推荐量调整并适当减少