1. 试剂盒的组成
1) 包被反应板(直接使用,勿水洗)…………………………….24/48孔
2) 玉米赤霉烯酮标准溶液…………..… …………...1套6瓶
(0,250,500,1000,2000,4000ng/L)
3) 样品稀释液…… ……………………………………………….…….1瓶
4) 第一抗体浓缩液:抗玉米赤霉烯酮抗体 …………………….….1/2瓶
5) 第一抗体稀释液……………………………………………………..1瓶
6) 酶标二抗浓缩液…………………………………………….……. 1/2瓶
7) 酶标二抗稀释液…………………………………………………….1瓶
8) 显色底物液a………………………………………………………..1瓶
9) 显色底物液b………………………………………………………..1瓶
10) 终止液……………………………………………………………….1瓶
11) 浓缩洗涤液(20×)……………………………………………….1瓶
12) 反应板支架………………………………………………………….1块
2. 仪器与设备的配置
2.1 微量移液器,量程20~200µl(若可能,可选配8道或12道微量移液器)
2.2 酶标仪(带450nm波长)
2.3小型粉碎机或均质机
2.4 离心机
2.5 冰箱
2.6 分析天平
2.7 玻璃器皿:锥形瓶、烧杯、碾钵、滴管、移液管等
3. 操作流程图
加样 37℃,60分钟 37℃,30分钟
样品提取→试剂准备—→免疫反应—――—→酶标二抗反应————→显
37℃,15分钟
色反应—————→结果判定
4. 样品处理
谷类与饲料样品
称取粉碎过筛(20目)试样5.0g于具塞三角瓶中,加入25mL50%甲醇-水溶液,密塞,充分振摇5分钟,静止片刻,过滤。量取一定体积滤液用样品稀释液适当稀释(比如10倍),即为待测样液。取待测样液50µL直接加样于微孔中,进行ELISA检测。
5. 实验准备
5.1 浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍,使用前稀释。(例如:3mL浓缩洗涤液+57mL蒸馏水,足够24孔使用)
5.2 第一抗体配制方法:在使用前,取1瓶第一抗体浓缩液,准确加入1.5mL第一抗体稀释液,混匀,配制成实验用第一抗体溶液,够24孔反应板使用。
5.3 酶标二抗配制方法:在使用前,取1瓶酶标二抗浓缩液,准确加入5.0mL酶标二抗稀释液,混匀,配制成实验用酶标二抗溶液,够24孔反应板使用。
5.4 虽ZON标准浓度很低,但是严格规范的实验操作不可忽视,凡接触到标样的器皿都要用3.7%甲醛处理。
6. 实验步骤
6.1试剂平衡:将测试盒取出,放置15分钟以上,平衡至室温。
6.2小孔编号:移取所需微孔放置反应板支架上,不要冲洗。设定1号孔为酶标仪调零孔,2-7号为玉米赤霉烯酮标准对照孔,其余为样品孔。
6.3 免疫反应:按系列步骤所示,依次加入配制好的溶液及样品液。
第一步:1号孔加入50µL样品稀释液,2-7号孔分别加入50µL系列浓度(0,250,500,1000,2000,4000ng/L)的标准品,其余孔加入相应的样品提取液。
第二步: 1号孔内加入50µL抗体稀释液,在其他所有微孔中加入50µL第一抗体溶液。
第三步:轻轻振摇,使各孔中反应物混匀。
第四步:37℃,孵育60分钟。
反应物组成表
|
操作
次序 |
加入量 |
孔号 |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
第一步 |
50µL |
样品稀释液 |
0 |
250 |
500 |
1000 |
2000 |
4000 |
样品 |
|
第二步 |
50µL |
抗体稀释液 |
第一抗体 |
|
第三步 |
摇 匀 |
|
第四步 |
37℃,孵育60分钟 |
6.4洗涤:倒掉板中液体,每孔加入250µL洗涤液,洗液不得溢出,放置1分钟后,甩掉洗液,在吸水纸上拍干,重复洗涤3次。
6.5 酶标二抗反应:每孔加入100µL酶标二抗溶液,37℃,孵育30分钟。
6.6 洗涤:倒掉板中液体,每孔加入250µL洗涤液,洗液不得溢出,放置1分钟后,甩掉洗液,在吸水纸上拍干,重复洗涤5次。
6.7 在每个小孔内加入50µL底物a后,再加入50µL底物b溶液,混匀,在37℃保温箱中显色15分钟。
6.8 在每个微孔中加入50µL反应终止液 。
6.9 轻轻摇动微孔板,30分钟内在450nm处读取光密度值(OD值)。
7. 结果判定
以上述实验步骤测定的3-7号孔的OD值与2号孔的OD值的比值乘以100作为纵坐标,以标准溶液浓度的对数(lgC)作为横坐标,可以画出一条标准曲线图。
计算样品孔OD值与2号孔的比值,乘以100,查标准曲线,可得到相应样品浓度的常用对数值lgC,对其求反对数,可求得样品提取液中的玉米赤霉烯酮含量,为获得样品的浓度,读数的浓度必须乘以相应的稀释因子。
X——样品中玉米赤霉烯酮的含量(ng/kg)
C——从标准曲线上查得相对应样品浓度(ng/L)
V——样品提取液体积(25mL)
m——样品质量(5g)
n——样品提取液稀释倍数