动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒（含抗体）产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂（含抗体）是一种旨在从动物细胞或活体组织中分离出线粒体和细胞浆组分，从而检测细胞色素C的转运，即由线粒体释放到细胞浆，来探测细胞凋亡的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体和细胞浆组分的制备。可以被用于后续蛋白质西方杂交等实验。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离到位，质量保证。

技术背景

细胞色素C（CYTOCHROME C）在细胞凋亡中扮演着重要作用。细胞色素C位于线粒体内外膜之间。当细胞凋亡时，它从线粒体内释放到细胞浆里，引起一系列的信号通道的下游反应。

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   120毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI净化液（Reagent C）    10毫升

YIJI强化液（Reagent D）     5毫升

YIJI保存液（Reagent E）   100毫升

YIJI活性液（Reagent F）   100微升

YIJI溶解液（Reagent G）     1毫升

YIJI上样液（Reagent H）   500微升

YIJI抗体液（Reagent I）    50微升

产品说明书 1份

保存方式

保存YIJI净化液（Reagent C）、YIJI活性液（Reagent F）和YIJI抗体液（Reagent I）在-20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞

硬组织处理液（Reagent I）：用于促进硬组织表面溶解

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞培养所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

实验步骤

一、动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项5）
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒 GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的500微升YIJI强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）
• 加入预冷的5毫升YIJI保存液（Reagent E），用手混匀
• 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒－GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 放进37℃培养箱3分种
• 手击振动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
• 合并移入到1个50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项5）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒－GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 放进37℃培养箱3分种
• 手击振动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液
• 合并移入到1个50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A）
• 放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的500微升YIJI强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）
• 加入预冷的5毫升YIJI保存液（Reagent E），用手混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进台式微型离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒－GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

五、动物硬组织线粒体分离（组织匀浆法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入适量的（1克组织需要10毫升）YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升YIJI硬组织处理液（Reagent J），充分混匀
• 放进冰槽里孵育3分钟
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的3毫升YIJI清理液（Reagent A）和2毫升 YIJI净化液（Reagent C），充分混匀
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项5）
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒－GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

六、动物硬组织线粒体分离（化学处理法）

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，然后移出10微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI净化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一个液氮冻存管
• 即刻放入液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升YIJI硬组织处理液（Reagent J），充分混匀
• 放进冰槽里孵育3分钟
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的3毫升YIJI清理液（Reagent A）和2毫升 YIJI净化液（Reagent C），充分混匀
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的500微升YIJI强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）
• 加入预冷的5毫升YIJI保存液（Reagent E），用手混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
• 即刻放进－70℃冰箱里备用
• 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• 加入100微升YIJI溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 涡旋震荡15秒
• 放进冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进4℃微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，即刻保存在－70℃冰箱里备用
• 继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI－Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

• 分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管
• 加入20微升YIJI上样液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 放进台式微型离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作（12％SDS-PAGE）
• 使用10微升YIJI抗体液（Reagent I）进行西方杂交（注意：建议使用YIJI蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒－GMS30005.1）
• 比较细胞色素C的浓度变化和差异

注意事项

• 本产品为10次操作（1克动物组织或5 X 10⁷细胞）
• 所有操作均须在4℃或以下状态下进行
• 操作时，须戴手套
• 操作时，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 通常匀化次数为80下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
• 5 X 10⁷细胞约1克重量
• 建议使用足够的细胞量
• 建议严格控制操作时间
• 通常5 X 10⁷细胞或1克动物组织的线粒体含量为50微克线粒体蛋白
• 建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒（GMS30030.1）测定蛋白浓度
• 保存在－70℃冰箱里的蛋白样品严格避免反复冻融
• 加入10微升YIJI抗体液（Reagent I）到5毫升体系里，为兔抗单克隆抗体，可以用于检测人、小鼠、大鼠、兔、马、鸡、牛等。二抗需使用抗兔二抗
• YIJI抗体液（Reagent I）适合5次Western Blot实验
• 本公司提供系列细胞色素C试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶