黄曲霉毒素M1快速检测 ELISA试剂盒
生产商：美国clover公司 总经销商：北京中检维康生物技术有限公司 联系人小薛13366849880


引言：
黄曲霉毒素是天然存在的霉菌衍生代谢产生的一种毒素，已经被证明是1类致癌物，黄曲霉毒素 M1 是存在动物奶中的黄曲霉毒素 B1 的代谢产物，通常出现在奶，奶制品，以及动物组织中。同样具有很强的致癌性，本产品利用酶联免疫吸附的方法，检测奶及奶制品中黄曲霉毒素M1的含量，检测限为0.05μg/l即50ppt（奶粉）。
原理：
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板上包被有过量的针对黄曲霉毒素的单克隆抗体，含有黄曲霉毒素的样品或标准品被加入到小孔中，经过孵育抗原与抗体结合，然后，加入过量的辣根过氧化物酶（HRP）标记的黄曲霉毒素M1，经过孵育抗体会将标记的抗原结合，洗板，未结合的酶标记物会被洗掉，加入显色液到孔中并且孵育，发生变色反应成蓝色。加入反应停止液后由蓝色转为黄色。在450nm处测量，吸光强度与样品中黄曲霉毒素M1的浓度成反比。
检测下限： 50ppt(奶粉)
检测时间： 2小时30分
试剂盒的组成：
—96孔酶标板：12条╳8孔（包被有抗兔IgG）
—标准液6瓶：3ml /瓶，为黄曲霉毒素M1标准品，浓度分别为： 0 ppt； 5 ppt； 10 ppt；
25ppt； 50 ppt； 100 ppt
—黄曲霉毒素M1酶标记物：15 ml ------- 绿色
—底物溶液（显色液）：15 ml ------- 蓝色
—反应停止液（酸溶液）：15 ml ------- 红色
—空白去脂奶（用于奶酪样品处理） ------- 白色
—洗夜（溶于1L纯水中使用）：1包
需要设备及试剂（盒中未提供）
设备：
——试管，计时器，吸水纸，洗瓶
——微孔酶标仪（450nm）
——离心机
——单道或多道移液器
——氮气吹干仪/旋转蒸发器
——涡旋振荡器
工作液的准备：
标准清洗液：将洗液包用1L纯水溶解，即为清洗液。

样品前处理：
生奶：
1、脱脂生奶可以直接用于测试。
2、全脂生奶：取10ml样品，在2 - 8℃放置1-2小时后，放入离心机内2000g离心5分钟，取脂肪层下清液用于测试。
奶粉：（稀释倍数10）
将1g奶粉溶于10ml纯水中，按生奶方法处理。
奶酪：（稀释倍数5）
将1g切碎的奶酪，用5ml甲醇溶解，混合5分钟，在离心机上5000g离心5分钟，取0.5ml上清液，氮气或者空气吹干，用0.5ml空白去脂奶（试剂盒内提供）溶解后用于测试。
操作步骤：
1、 从模板中取出所需的微孔板条并插入框架内。将不用的微孔条放入带有干燥剂的锡箔袋中。将所有与实验相关的物品升至室温。
2、 记录好样品和标准品的位置。
3、 在微孔板上，每孔加入相应的200μl样品和标准品。
4、 封好微孔板，室温下（19-25℃）避光孵育2小时。
5、 倒空微孔板，用多道移液器，每孔加入250μl洗液，轻微震荡后，倒空，并在吸水纸上排干。如此重复3次。
6、 每孔中加入100μl酶标记物（绿瓶），封口后，室温下避光孵育15分钟。
7、 重复步骤5洗板。
8、 每孔中加入100μl底物（TMB显色液，蓝瓶），室温孵育15 - 20℃。
9、 每孔中加入100μl停止液，底物会变为黄色。
10、 震荡混匀后，在酶标仪上450nm虑光片检测。
结果计算：
1、 用样品或标准液吸光度值（B）除以零标准吸光度值（B0）再乘以100，
样品吸光度值（或标准液） B
————————————×100=——（%）
零标准吸光度值 B0

根据B/B0的值做出每一个标准样品的半对数曲线，相对应每一个样品的浓度就可从曲线上读出。
2、 用特定的软件进行计算。
结果：
由于样品在反应中经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的待测样浓度一定要再乘以其稀释倍数才能得出其在样品中的正确含量。

试剂盒特点：
本试剂盒使用的单克隆抗体与几种黄曲霉毒素的交叉反应率为：B1 100%;B2 76%;G1 55%;G2 6%;M1 79%;M2 33%。显然，抗体并不是特异性的针对黄曲霉毒素M1，但是在奶及奶酪中含有的黄曲霉毒素，只会有M1，所以本试剂盒适用于奶及奶样中黄曲霉毒素M1的测试。
回收率：
50ppt奶样品的回收率情况：
回收率 重复试验变异系数
脱脂奶 100% 4.2%
1%脂肪含量奶 93% 4.4%
全脂奶 92% 2.2%
奶酪样品回收率：
1g奶酪中添加100pg黄曲霉毒素M1，在室温下放置1小时后的回收率为60.%，重复试验的变异系数为5.5%。
注意事项：
1、 室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20-24℃）会导致所有标准的值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 标准物质和显色液对光敏感，最好避免直接暴露在光线下。
4、 混合要均匀，洗板要彻底（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5、 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6、 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵敏度降低。
7、 试剂盒的储存条件是2-8℃，不要冷冻。