黄曲霉毒素总量ELISA定量检测试剂盒

黄曲霉毒素总量ELISA定量检测试剂盒
生产商：美国clover 总经销商：北京中检维康生物技术有限公司

引言：
黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物，坚果，棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。农作物被收获后有可能被下列的一种或几种黄曲霉毒素污染：B1、B2、G1、G2。黄曲霉毒素B1是最主要的毒素，经常被检测到，其他几种黄曲霉毒素在高浓度的情况下也有很大的危害。黄曲霉毒素会严重危害人体健康，导致肝癌，黄曲霉毒素慢性中毒以及慢性肝炎等疾病。动物食用被黄曲霉毒素污染的饲料也会产生危害，会导致慢性疾病，生殖抑制，免疫抑制，产奶量或产蛋量减少等症状，长期食用还会导致死亡。因此世界各国都对人类食品和动物饲料中的黄曲霉总量有严格的标准。准确的检测食品和饲料中的黄曲霉毒素总量就显得非常重要。

试验方法的原理
黄曲霉毒素总量试剂盒的工作原理是酶联免疫吸附分析法。鼠抗黄曲霉毒素的抗体包被在酶标板的小孔中，用70%的甲醇将样品中的黄曲霉毒素萃取后，将含有黄曲霉毒素的萃取液或标准品和过氧化物酶标记抗原加入到小孔中，此时过氧化物酶标记黄曲霉毒素和样品、标准品中游离的黄曲霉毒素竞争性地与包被在板上的抗体结合。在室温下温育清洗后，加入底物溶液，室温孵育一段时间，发生蓝色反应。加入停止液，终止颜色反应，蓝色变成黄色。用酶标仪在450nm处测定光密度值（OD），样品中黄曲霉毒素总量的浓度与OD值成反比关系。

试剂盒中所包含的试剂：
1． 酶标板1块：包括12条，每条含有8个小孔，每个孔中均包被有鼠抗黄曲霉毒素的单克隆抗体
2． 稀释板1块：没有包被的12条8孔板。
3． 6瓶黄曲霉毒素标准品浓度分别为：0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 ng/ml（ppb），每瓶1.5 ml．
4． 酶标记物（过氧化物酶标记的黄曲霉毒素）：25 ml。
5． 底物溶液（TMB）：15 ml。
6． 停止溶液(0.5 M H2SO4)：15 ml。

需要的其它试剂和设备（试剂盒没有提供）：
粉碎机：能将样品磨至速溶咖啡颗粒大小。
萃取容器：至少125ml。
天平：20克以上的称量范围。
100ml量筒。
每个样品70ml试剂级甲醇。30ml去离子水或蒸馏水。
滤纸：Whatman 1 型或同类型滤纸。
过滤漏斗。
移液器和吸头：100l和200l。
计时器。
洗瓶。
吸水纸。
酶标仪（450nm）。

注意事项：
为了保证测定结果的可靠性，请按照下列良好实验室操作规范（GLP）进行实验
1． 在进行分析操作之前，请将所有的试剂回温到室温(19-27°C)。
2． 使用前，试剂储存在2 - 8°C，不要冰冻。
3． 未用完的试剂不要倒回原瓶中，按照实验所需的量取用试剂。
4． 实验过程中注意保证温度和反应时间。
5． 所有的试剂在使用前，通过翻转摇动进行充分的混合，但不要引起泡沐的产生。
6． 一当实验开始，所有的操作步骤应该在规定的时间内完成，不要中断或者超时。
7． 所有的试剂瓶操作完成后立即盖好盖，不要将不同试剂瓶的盖混用。
8． 每个样品只能用自己的吸头，不能混用，防止交叉污染。
9． 所有的样品和标准物必须同时使用，所有的试验条件保持一致。
10． 不要将不同批次的试剂混用。
11． 不要使用过期的试剂。
12． 要经常的检查酶标仪和微量移液器的精度和准确度。

健康和安全注意事项
1． 在实验室不要吸烟、吃东西、喝水、用嘴吸移液管。
2． 避免底物和停止液与皮肤和粘膜接触（可能产生刺激、灼烧和有毒危害）。如果接触了，请用大量的水进行清洗。
3． 化学物品的处理必须按照良好实验室操作规范（GLP）进行。
4． 黄曲霉毒素是毒性极强的物质。它们能够致癌、对基因造成不可修复的损伤。吸入、吞食和皮肤接触，黄曲霉毒素均会致毒。所以，试验人员必须穿防护服。

样品的制备：
注意：样品收集必须按照规定的程序进行。
1. 在70ml甲醇中加入30ml蒸馏水或去离子水，配制70%的甲醇溶液。
2. 将收集的样品磨碎至速溶咖啡大小的粉末（50%可以通过20目的网筛）。
3. 在容器中称取20g磨碎的样品，加入100ml配置好的甲醇溶液。
4. 将容器密闭好后，摇晃，或者利用搅拌机搅拌1-2分钟。
5. 待稍微沉淀后，在上清液中取5-10ml，利用滤纸过滤后用于实验。

ELISA分析操作步骤：
推荐使用多道移液器，以保证实验的统一性。
1． 将所有的试剂回至室温
2． 准备稀释板，在要加入标准品和待测样品的孔做好记号，对应酶标板。
3． 每孔中加入200µl酶标记物。
4． 在相应的空中加入100µl标准品和待测样品，用移液器吸吹至少3次，充分混匀。
5． 更换吸头，在稀释板上每孔中吸取100µl混合好的溶液，加在对应的酶标板孔中，室温下孵育15分钟。
6． 翻转将酶标板小孔中的溶液倒掉，用蒸馏水或去离子水洗板5次。翻转酶标板在吸水纸上拍打，将其中的溶液拍干。清洗过程十分重要。做的不好，测定结果的重复性会比较差，造成吸光度值偏高。
7． 在酶标板上每孔中加入100µl底物溶液，室温下孵育5分钟
8． 再在酶标板每孔中加入100 µl停止液。
10．混匀后，在酶标仪上用450 nm进行测定每孔的吸光度值。

测定结果的计算：
1． 计算光密度平均值。
2． 制作标准曲线：在半对数坐标纸上，取光密度平均值作为纵坐标（Y），标准溶液的浓度值作为横坐标（X）。
3． 对于每个样品，用其光密度平均值在标准曲线上找对应的浓度值。
4． 稀释过的样品必须要乘以稀释因子（倍数），才是最终的测定结果（可以以pg/ml 或者 pg/g表示）。按照说明书提供的样品处理方法稀释因子是5。
5． 通过标准曲线可以测量的范围是1 - 20ppb，如果样品中黄曲霉含量过高，可以再用70%的甲醇稀释提取液，然后重新测定。

四种黄曲霉毒素的交叉反应率：
B1 —— 100% ；　 B2 —— 77% ；　G1 —— 64% ；　G2　——　25%。