辅酶ⅠNAD(H)含量检测测定试剂盒说明书 可见分光光度法
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货号: RJ-C-A000规格: 50T/24S

测定意义：辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：
酸性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃保存 试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存，用时加入 6.1mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周； 试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 6.6mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周； 试剂五：液体 3mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂六：液体 40mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂七：自备，将 72mL 乙醇和 3mL 蒸馏水充分混合备用。 NAD 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。 NADH 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.4mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。 产品说明： 辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解，糖异生，三羧酸循环和呼吸链中发挥 着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD，使之成为 NADH（还原型辅酶 I）。而 NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。。NAD(H)在机体内有重要 的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅 酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。 分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧 化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570 nm 下检测吸光值， NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进 一步采用 MTT 还原法检测。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、NAD+和 NADH 的提取： 1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分 ，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200uL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。 NADH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分 散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 2、组织中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积碱性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。 二、测定步骤： 1、 分光光度计预热30分钟以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。 2、 操作表（在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样） 试剂名称 对照管(µL) 测定管(µL) NAD 或 NADH 标准管 空白管 上清液 50 50 - - 标准溶液 - - 50 - 蒸馏水 50 试剂六 500 - - - 试剂一 250 250 250 250 试剂二 75 75 75 75 试剂三 75 75 75 75 试剂四 75 75 75 75 试剂五 35 35 35 35 充分混匀，室温避光静置20min 试剂六 - 500 500 500 充分混匀，静置5min后，15000rpm，25℃离心15min，弃上清，沉淀中加入： 试剂七 1000 1000 1000 1000 第3页，共 3 页 混匀， 570nm 下比色，读取吸光值ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，NAD 标准管的记为ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。 NADH 标准管的记为ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。空白管只需做一 到两次。 注意事项： 1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。 2、反应过程要注意避光。 3、当吸光值大于 1 时，建议稀释后测量，计算公式中应当乘以稀释倍数。 NAD+含量的计算 1、血清（浆）中 NAD+含量计算 NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 (2)按样本鲜重计算 NAD+ (nmol/g 鲜重）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W (3)按细菌或细胞密度计算 NAD+ (nmol/104cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 NADH 含量的计算 1、血清（浆）中 NADH 含量计算 NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷V 血清==12.5×ΔA 测定÷ΔA 标 准 2 2、组织中 NADH 含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷(V 样品×Cpr)= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 (2)按样本鲜重计算 NADH (nmol/g 鲜重）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷W=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W (3)按细菌或细胞密度计·算 NADH (nmol/10 4cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 C 标：NAD 或 NADH 标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；V 提取：加入提取液总体积，1mL；V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本鲜重，g；500:500 万个细胞。