【产品规格】
BPMPro100  100 Reactions/盒
【产品说明】
支原体(Mycoplasma)：目前发现的最小原核生物，据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。
本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液，细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：配合推荐使用的核酸抽提方案，检测灵敏度达到10CFU/ml。
可靠：抽提加入内标核酸，全过程质量控制。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
方便：操作简单，无需电泳步骤。
【有效期】
规定储存条件下6个月。
-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃继续使用1周。
【产品组分】
表1   产品组分

组分名称	装量	储存条件
Biowing® MyqPCR Reaction Mix1	475 ul×2管	-20 ℃，避光
Biowing®MyPrimer&Probe Mix2	25 ul×2管	-20 ℃，避光
阳性质控（PC)	50 ul×2管	-20 ℃
内部质控（IC)	50 ul×2管	-20 ℃
RNase Free Water	50 ul×2管	-20 ℃
石蜡油	750 ul×2管	-20 ℃

注：
1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。

1. 内部质控含有内标DNA。

在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意事项和无菌操作规范！
【操作步骤】
1.样本制备

1. 样本的标准制备方案：请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA，作为模板进行 qPCR 反应。
2. 前处理阴性样本准备方案：将RNase Free Water当成样本，加入内部质控，进行核酸抽提。

2. qPCR 反应液的准备
 

1. 根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3个重复孔。
2. =1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3
   1. 根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：

Mix =（反应孔数+1）×10 μl
各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：
表2  qPCR Mix的配制

组分/样品管	Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 (µL)	MyPrimer& Probe Mix2 (µL)	总体积 (µL)
1人份	9.5	0.5	10
N人份	9.5N	0.5N	10N

 
1.加样
（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。
（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。
（4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：
表 3 加样示例

PCR模板	qPCR Mix	总体积
PC 20 μL	10 μL	30 μL
qPCR 阴性20 μL	10 μL	30 μL
前处理阴性20 μL	10 μL	30 μL
样本A重复1 20ul	10 μL	30 μL
样本A重复2 20ul	10 μL	30 μL
样本A重复3 20ul	10 μL	30 μL

【注】：此时每个反应孔的体积为30μL。
qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。
PCR 仪设置以 ABI 7500 为例，相对定量模式，选择
TaqMan 探针法：

步骤		循环数	温度	时间
1	预变性	1	94℃	5 min
2	变性	15	95℃	10 s
	退火与延伸		65℃	90 s
3	变性	25	95℃	10 s
	退火与延伸		65℃	30 s
65℃延伸时收集荧光信号
通道选择：样本检测通道-FAM；内参检测通道-HEX，无 HEX 通道，可使用VIC 通道。ABI 系列荧光定量 PCR 仪 需 ROX 校准，Passive reference 选择ROX。

• 1、该程序为两阶段扩增法，如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光，按照正常Ct值判断结果；如果只能最后一步收集荧光，需要在原数据的基础上加15个Ct值。

1. ROX设置是以7500为例，但也存在例外，例如StepOne。

【阈值设置】
以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，如果不能两阶段收集荧光，基线设置1~2个循环；如果可以，基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。

1. 内参(HEX/VIC)阈值设定：以阳性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的Ct 值定为 28±2。
2. 支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。

【实验质量控制】：
如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30，但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常，表明阳性支原体对照模板有降解。
如果样品前处理阴性的内参（HEX/VIC)Ct 值>30，阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ，表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。
【结果判读】
根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定，具体标准如下：

PCR 模板	支原体(FAM)Ct 值	内标(VIC) Ct 值	判定说明
阳性对照	≤30	－	阳性成立
	>30	－	阳性不成立
qPCR阴性对照	≥37.5	≥37.5	阴性成立
	＜37.5	＜37.5	阴性不成立
样本前处理阴性	≥37.5	≤30	阴性成立
待测样品反应孔	＜37.5	≤30	阳性
	≥37.5	≤30	阴性

要求每个检测样品做3重复，如果3复孔中，两重复为阳性，则判读为阳性；建议做样本前处理阴性，可以质控整个抽提过程。
 
注：检测结果异常时：

1. 样品前处理阴性：内参Ct值过大，表明抽提效率低；支原体检测通道Ct值小于37.5，可能前处理抽提过程存在污染。
2. qPCR阴性：支原体和内参检测通道Ct值小于37.5，操作过程存在污染。
3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。

【 PCR过程注意事项】
由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：

1. 试剂盒开启后，阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。
2. 每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
3. 要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。
4. 建议自备转运盒，用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。
5. 建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
6. 建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台，样本的加样在另外一个无菌操作台。
7. 建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。
8. 应按照先加阴性，再加样本，最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。
9. qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。
10. 上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底
11. 盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
12. 本产品仅作科研用途。