动物硬组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒

动物硬组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

动物硬组织线粒体可溶性总蛋白制备试剂是一种旨在从动物硬组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器，并在蛋白酶抑制混合剂的帮助下，使已纯化的线粒体膜结构破裂而获得线粒体内活性蛋白酶系统的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物硬组织（动物和人体的心肌、骨骼肌等）中线粒体总蛋白的制备。可以被用于细胞凋亡、信号传递、古生物、衰老、代谢和营养学等的研究。可直接用于特定蛋白后续纯化、蛋白一维或二维电泳、西方杂交、免疫抗体和质谱分析等等。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。线粒体中含有丰富的细胞色素氧化酶系统和细胞凋亡相关蛋白等。通过机械或化学方法破裂细胞，进而差速离心获得线粒体，然后通过特殊裂解液和蛋白酶抑制混合剂防止裂解后线粒体内各种活性蛋白成分遭到活化的内源性蛋白酶的破坏，充分保留线粒体内蛋白质的免疫和生物学活性，最后进行相关蛋白的独立分析。

产品内容

清理液（Reagent A）   120毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

净化液（Reagent C）    60毫升

强化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   160毫升

酶解液（Reagent F）       100毫升

破膜液（Reagent G）         2毫升

活性液（Reagent H）    20微升

上样液（Reagent I）     3毫升

产品说明书          1份

保存方式

保存净化液（Reagent C）、酶解液（Reagent F）和活性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

4℃台式离心机：用于样品操作

微型4℃台式离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

涡旋震荡仪：用于混匀

实验步骤

方法一：物理法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时） 
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）
• （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升酶解液（Reagent F），充分混匀
• 放进冰槽里孵育3分钟
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的3毫升清理液（Reagent A）和2毫升 净化液（Reagent C），充分混匀
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项8）
• 将所有组织匀浆物移入预冷的15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• （选择步骤）加入预冷的3毫升保存液（Reagent E）
• （选择步骤）放进4℃台式离心机再次离心5分钟，速度为10000g
• （选择步骤）小心抽去上清液
•  加入100微升破膜液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 加入1微升活性液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 置入冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里
• 继续进行下列操作：

操作一、线粒体总蛋白定量检测

1） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

2） 加入20微升上样液（Reagent I）

3） 涡旋震荡15秒

• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分钟

6） 上样，进行电泳操作和西方杂交

方法二：化学法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前最好使动物空腹12至24小时）
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）
• （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）
• 移入一个液氮冻存管
• 即刻放入液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的5毫升酶解液（Reagent F），充分混匀
• 放进冰槽里孵育3分钟
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的3毫升清理液（Reagent A）和2毫升 净化液（Reagent C），充分混匀
• 放进4℃台式离心机离心2分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的5毫升裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的500微升强化液（Reagent D）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
• 加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
• （选择步骤）加入预冷的3毫升保存液（Reagent E）
• （选择步骤）放入4℃台式离心机再次离心5分钟，速度为10000g
• （选择步骤）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中
• 加入1微升活性液（Reagent H）
• 涡旋震荡15秒
• 置入冰槽中孵育15分钟
• 涡旋震荡60秒
• 放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
• 若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里
• 继续进行下列操作：

操作一、线粒体总蛋白定量检测

1） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

2） 加入20微升上样液（Reagent I）

• 涡旋震荡15秒
• 放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分钟
• 上样，进行电泳操作和西方杂交

注意事项

• 本产品为20次（1克动物组织）操作
• 实际操作的动物组织重量与试剂用量成比例调整
• 操作时，须戴手套
• 整个操作过程须在4℃条件下进行
• 使用时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 建议使用足够的样品量；建议使用1克动物硬组织
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为80下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。
• 通常孵育5分钟达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 对于难以裂解的组织，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
• 通常1克动物硬组织的线粒体含量为1至10毫克线粒体蛋白

12． 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少

• 如果需检测不可溶性线粒体蛋白，可保留线粒体裂解后的沉淀物，直接加入10微升上样液（Reagent I）和10微升无离子水，然后继续操作二的步骤3至6
• 线粒体蛋白须放在－70℃冰箱里储存备用，避免反复冻融
• 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定无蛋白酶污染
• 本产品经鉴定蛋白萃取产量高
• 本产品经鉴定纯化程度高