双参数细胞周期G0期流式细胞分析试

双参数细胞周期G0期流式细胞分析试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

双参数细胞周期G0期流式细胞分析试剂是一种旨在使用G0细胞周期标志性蛋白抑制素和DNA含量双重参数在细胞流式仪下，分析和区分细胞周期G0期的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动物、人体、植物等）的细胞周期G0期分析。广泛用于细胞繁殖，包括细胞衰老、细胞凋亡的研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞周期是评价细胞代谢、生理和病理状况的重要指标。通过DNA结合染料这一单一参数（univariate parameter），借助细胞流式仪，测定出DNA含量，根据DNA含量随着细胞周期的不同而发生变化，来确定和区别细胞周期的不同阶段，形成三种不同的细胞群，包括G0/G1、S、G2/M。而使用双参数（bivariate parameter），即特异性细胞周期表达蛋白和DNA含量，则可以区分G0和G1，G2和M。其中G0期又称为静止期（quiescent state或resting state），属于非繁殖性细胞。静止期细胞的蛋白合成是繁殖性细胞的20％。抑制素（statin），57KD的核蛋白，是细胞周期G0期的特异性标志（landmark）。抑制素只在细胞周期G0期表达，在其它细胞周期阶段均为表达阴性，与核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase；RR）的亚体M1的表达恰好相反，故用于区分G0和G1期，同时分析G0期分布情况。流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）是七十年代发展起来的集计算机、激光、流体力学、细胞化学、细胞免疫学为一体的高科学技术。

产品内容

清理液（Reagent A）    120毫升

固着液（Reagent B）     50毫升

通透液（Reagent C）     10毫升

抗体液（Reagent D）      1毫升

染色液（Reagent E）      1毫升

复染液（Reagent F） 5毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存固着液（Reagent B）、抗体液（Reagent D）、染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗体液（Reagent D）和染色液（Reagent E）严禁反复冻融；染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F），避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（12052）：用于中和胰蛋白酶的处理

15毫升锥形离心管：用于细胞收集的操作

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

台式离心机：用于细胞收集的操作

微型台式离心机：用于细胞收集的操作

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：

• 准备1个6孔细胞培养板的细胞（1 X 10⁶细胞/3毫升培养液/孔）
• 小心抽去细胞培养液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），铺满培养孔表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放进37℃细胞培养箱孵育1分钟
• 加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
• 移取细胞混匀液到15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为400g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为400g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入200微升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• （选择步骤）细胞计数
• 同时准备1个－20℃预冷的新的15毫升锥形离心管
• 加入5毫升－20℃预冷的固着液（Reagent B）
• 用200微升枪头一滴一滴加入细胞悬液到含有预冷的固着液（Reagent B）里，保持轻度涡旋震荡
• 置于冰槽里孵育2小时
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为400g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升预冷的清理液（Reagent A），上下抽吸混匀
• 转移到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指轻弹管底，使细胞颗粒松动
• 加入1毫升通透液（Reagent C）
• 涡旋震荡3秒
• 放进冰槽里孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指轻弹管底，使细胞颗粒松动
• 加入100微升抗体液（Reagent D），充分混匀
• 放进4℃冰箱里，孵育16小时
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指轻弹管底，使细胞颗粒松动
• 加入100微升染色液（Reagent E），充分混匀
• 室温下孵育60分钟，避免光照
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为800g（或3000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指轻弹管底，使细胞颗粒松动
• 加入500微升复染液（Reagent F），用枪头充分混匀
• 室温下孵育4小时
• 移入到细胞流式仪专用测试管（可放进4℃冰箱里待测），避免光照
• 即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光器，观察50000个细胞以上
• 建立地形图或散点图以及直方图分析

• 根据地形图或散点图，纵坐标Y轴为FL1（抑制素绿色荧光），横坐标X轴为FL2（PI红色荧光），分析如下：

• 根据横坐标X轴的DNA指数（DNA Index；DI）进行区域窗口划分（见参考图）
• 确定G0/G1期区域窗口
• 计算G0/G1期区域窗口的总细胞数
• 计算G0/G1期区域窗口的抑制素表达阳性细胞数
• 获得G0和G1期的百分比
• 获得单个区域窗口的Y轴的抑制素表达平均荧光读数
• 根据抑制素表达平均荧光读数，构建G0细胞周期动态变化曲线――纵坐标为抑制素表达平均荧光读数，横坐标为时间或药物浓度等
• 参考图如下：

注意事项

• 本产品为10次操作量
• 在整个操作过程中须戴手套，以防污染
• 孵育时，必须避免光照
• 建议不用抗体液（Reagent D），作为阴性对照
• 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞流式仪分析。如果放进4℃冰箱里待测，不要超过3天
• 细胞流式仪分析前，须混匀内容物
• 细胞检测量不得少于10000个
• 检测时，须弥补电子补偿，以去除双重参数的光谱重叠
• 告知流式仪技术员有关细胞类型
• 本公司提供系列细胞周期检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定标记清晰