人1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA试剂盒

                                 S1P试剂盒；人1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA试剂盒
 
适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本
 
检测原理：
       ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗人S1P单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人S1P会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗人S1P抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人S1P发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人S1P，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人S1P浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人S1P的浓度。

 [试剂盒性能]
1. 检测范围：75 nmol/L – 2400 nmol/L。
2. 灵敏度：最低检测浓度小于10 nmol/L。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。
原理图：


注意事项：
1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3.试剂盒使用前请在室温恢复30min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5.为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。
6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10 S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。
7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8.为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。
安全提示：
试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。
试剂盒组成及储存：

试剂盒组成	48孔配置	96孔配置	保存
说明书	1份	1份
封板膜	2片	2片
密封袋	1个	1个
酶标包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
标准品	0.3ml×6管	0.3ml×6管	2-8℃保存
酶标试剂	5 ml×1瓶	10 ml×1瓶	2-8℃保存
样品稀释液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
显色剂B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
终止液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
20×浓缩洗涤液	15ml×1瓶	25ml×1瓶	2-8℃保存

自备实验器材（不提供，可代购）
1．酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）
2．高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板机或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．双蒸水，去离子水，量筒等
6．稀释用聚丙烯试管


样本收集及储存：
1.细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000 ×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。
2.血清样本：
室温血液自然凝固20 min后，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3.血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20 min，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

试剂准备：
1.试剂回温：首先在实验前30 min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
2.配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
3.标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后按照以下浓度进行2倍稀释例如： 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、pg/ml进行稀释，2000pg/ml为标准曲线高点浓度，标准品/样本稀释液（SR1）作为标准曲线的零点（0pg/ml）。复溶过的标准品原液（2000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。


4.生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

5.酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

6.洗涤方法：
自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔，注与吸出间隔为30秒，洗板5次。
手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

检测步骤：

实验前30 min拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，请洗板3次并甩干

                                                            ↓

加入100ul标准品及检测样本到反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min

                                                            ↓

加入100ul生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min

                                                             ↓

加入100ul酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min

                                                              ↓

加入100ul显色底物至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育15min

                                                              ↓

加入50ul终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）

结果判断：
1.用酶标仪450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。
2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。
3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中S1P含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征：

标准品浓度（pg/ml）	OD值1	OD值2	平均值	矫正值
0	0.034	0.036	0.035	---
31.25	0.072	0.077	0.075	0.040
62.5	0.101	0.106	0.104	0.069
125	0.176	0.169	0.173	0.138
250	0.344	0.326	0.335	0.300
500	0.592	0.554	0.573	0.538
1000	1.293	1.078	1.186	1.151
2000	2.187	2.259	2.223	2.188

1. 数据及标准曲线

应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算人S1P的样本含量。

2. 灵敏度：
低可检测人S1P浓度达16pg/ml，
20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。

3. 特异性：
不与人BMP-1，Collagen II，Collagen III α1，Collagen XXIII α1，Mrc2等反应。

4. 重复性：
板内，板间变异系数<10%。

5. 回收率：
在选取的健康人血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的人S1P，计算回收率。

样本类型	平均回收率（%）	范围（%）
血浆	97	92-102
细胞培养上清	98	94-102

• 线性稀释：
  分别在选取的4份健康人血浆和细胞培养上清中加入高浓度人S1P，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。

稀释比例	回收率（%）	血浆	细胞培养上清
1：2	平均收率（%）	96	97
	范围（%）	94-100	93-101
1：4	平均收率（%）	97	98
	范围（%）	94-100	93-103