FrCas9核酸酶

通过已建立的流程化新型CRISPR筛选鉴定平台，我司发现来自啮齿粪杆菌Faecalibaculum rodentium的一种新型FrCas9核酸酶，是目前已知的切割效率最强、脱靶效应最低、特异性最好、PAM限制最少的CRISPR，显著优于目前最常用的SpCas9。FrCas9属于Type II-A型CRISPR，与SpCas9的同源性小于80%，体积为1372个氨基酸（图1A、B）。

FrCas9的PAM为5′-NNTA-3′，SpCas9的PAM为5′-NGG-3′，我们直接在人基因组上选择11个位点同步比较FrCas9与SpCas9及不同SpCas9高保真变体（SpCas9-HF1、HiFi-Cas9和eSpCas9）的切割效率及脱靶效应。在这里我们用到的方法为舒桐医疗科技自主研发的GUIDE-seq脱靶检测技术。结果显示，FrCas9的在靶reads数均高于SpCas9及其高保真变体，且FrCas9在多个位点均未检测到脱靶，说明FrCas9具有较高的切割效率以及较低的脱靶效应(图2C、D)，为安全高效的基因编辑临床治疗及基础科研提供更多选择。

我们发现FrCas9的PAM（NNTA）为回文序列（图3E），即：同一个PAM区域，正链和负链各存在一个靶点。因此，我们进一步将FrCas9突变为nicking形式的切口酶（nFrCas9），发现E796A突变位点的nFrCas9编辑效率最高，其CBE及ABE的编辑窗口分别为6-10位碱基以及6-8位碱基，二者在ClinVar数据库中的编辑范围分别有90.38%和92.21%（图3F）。与SpCas9对应碱基编辑器不同的是，FrCas9独特的回文PAM可以同时编辑PAM上下游序列，进而拓宽FrCas9基因编辑器的范围，因此FrCas9在单碱基编辑上具有极大的应用潜力。

另外，由于FrCas9的PAM为NNTA，与TATA box序列完美匹配，可直接靶向基因TATA区域，可应用于如下场景：1)基因敲除。通过切割TATA-box，FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表达分别降低了31.37%、49.91%和39.62%，达到基因敲除的目的；2)基因转录抑制。dFrCas9可通过抑制RNA聚合酶与TATA-box的结合进而抑制目标基因转录。通过结合TATA-Box,FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表达量分别降低了61.67%、45.61%和42.60%；3)基因转录激活。通过CRISPR激活实验表明dFrCas9-VP64能够有效地进行转录激活，且在ABCA1、GH1和MBL2中的激活效率高于dSpCas9-VP64（图4G、H）。FrCas9为基础科研提供了直接的基因调控工具。

FrCas9产品及应用
1.提供GMP级别的FrCas9蛋白；
2.与sgRNA在体外结合使用，进行体外切割，验证sgRNA的活性及切割效率（见图5A）;
3.转染到细胞中靶向切割进行基因编辑（见图5B）;
4.注射到胚胎或动物体中进行体内基因组编辑。

FrCas9产品优势
1.高纯度高活性的Cas9蛋白，切割效率强、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少；
2.所纯化的Cas9蛋白都进行了活性验证，无核酸酶污染;
3.提供工业级大包装：可按要求进行不同规格定制