Green CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）是一种具有细胞膜渗透性可对细胞进行示踪的硫醇反应性（thiol-reactive）荧光染料。CMFDA是二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）的氯甲基衍生物，本身没有荧光。当其穿透细胞膜进入活细胞后，CMFDA中的亲脂性基团可被胞浆内酯酶水解，生成5-氯甲基荧光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基荧光素可发出绿色荧光（Ex=492nm，Em=517nm），后者因带电荷不能自由穿透细胞膜而留在细胞内，然后可以与细胞内含硫醇的蛋白质和肽反应形成醛固定的结合物。该探针也可以首先与细胞内含硫醇的生物分子反应，但是结合物是非荧光的，直到其乙酸酯被除去。

CMFDA具有理想的“跟踪”特性，荧光非常稳定，无毒（工作浓度范围内），可以在活细胞中保留数代（通常三到六代），可以多代跟踪细胞运动。CMFDA稳定标记的时间至少72小时。在细胞分裂增殖过程中，CMFDA标记荧光可分配到两个子代细胞中，且几乎不会使邻近细胞染色（有极少情况下通过细胞间缝隙连接发生染色）。

CMFDA最适合与红色荧光染料和蛋白质共染，如红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP），橙色CMRA和CMRA染料[1,2]。CMFDA通常被用来标记干细胞[3,4]。

References:

[1] Trontelj K, Usaj M, Miklavcic D. Cell electrofusion visualized with fluorescence microscopy. J Vis Exp. 2010;(41):1991. Published 2010 Jul 1.

[2] Yang XP, Gallo M, Ngan I, et al. Use of CMFDA and CMTMR fluorescent dyes in FACS-based antibody screening. Biotechniques. 2002 Mar;32(3):678-80, 682.

[3] Bergenheim F, Seidelin JB, Pedersen MT, et al. Fluorescence-based tracing of transplanted intestinal epithelial cells using confocal laser endomicroscopy. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):148. Published 2019 May 27.

[4] Andrzejewska, A., Jablonska, A., Seta, M. et al. Labeling of human mesenchymal stem cells with different classes of vital stains: robustness and toxicity. Stem Cell Res Ther 10, 187 (2019).