简介:
植酸(植酸;肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸)是植物种子中肌醇和储存磷的主要来源,约占总磷的70%。谷物中植酸的丰富是食品和动物饲料行业关注的问题,因为由于缺乏内源性植酸酶,单胃动物无法获得这种形式的磷;植酸去磷酸化的特异性酶。此外,植酸的强螯合特性降低了其他必需膳食营养素的生物利用度,如矿物质(如Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+/3+)、蛋白质和氨基酸。2高植酸含量的饲料通常补充无机磷酸盐,但这会导致粪便磷酸盐水平升高,进而导致水道富营养化。或者,补充商业植酸酶越来越受欢迎,减少了对无机磷酸盐补充的需求以及相关的环境问题。
目前,还没有商业上可用的、简单的、定量的植酸方法,虽然这种测量相对复杂,但普遍接受的AOAC方法986.11存在局限性。对于每个单独的分析,该方法需要繁琐的阴离子交换纯化,这里的一个主要固有假设是只有植酸被纯化。虽然这一假设对于植酸占总肌醇磷酸盐至少97%的非加工谷物是可行的,但对于可能含有更高水平的一些较低肌醇磷酸盐形式(即IP3、IP4、IP5)的加工食品和饲料来说是不可行的,这些形式会与植酸共洗脱,导致植酸含量被高估。
鉴于从低级肌醇磷酸盐形式中分离植酸的纯化和测量的复杂性,Megazyme开发了一种简单的定量方法(K-PHYT)来测量食品和饲料样品中释放的总“有效磷”,该方法适用于大量样品,不需要繁琐的阴离子交换纯化。1这种方法涉及肌醇磷酸盐的酸提取,然后用植酸(IP6)和低级肌醇磷酸盐类型(即IP2、IP3、IP4、IP5)特有的植酸酶处理。随后用碱性磷酸酶处理可确保最终磷酸盐从肌醇磷酸盐(IP1)中释放出来,IP1对植酸酶的作用具有相对抗性。使用改进的比色法测量释放的总磷酸盐,并以每100克样品材料的磷克数表示。
碱性磷酸酶也会从磷酸肌醇以外的单磷酸酯中释放磷酸盐,但使用K-PHYT对大量样品的分析表明,磷酸肌醇以外单磷酸酯释放的磷很小。
原理:
植酸酶将植酸(植酸盐;六磷酸肌醇)水解成肌醇(磷酸盐)n和无机磷酸盐(Pi)(1)。
(植酸酶)
(1) 植酸+H2O——>肌醇(磷酸盐)n+Pi
碱性磷酸酶(ALP)进一步水解肌醇(磷酸盐)n,产生肌醇和Pi(2)。
(ALP)
(2) 肌醇(磷酸盐)n+H2O——>肌醇+Pi
Pi和钼酸铵反应形成12-磷钼酸,随后在酸性条件下还原为钼蓝(3,4)。
(3) Pi+钼酸铵——>12-磷钼酸
(4) 12-磷钼酸+H2SO4/抗坏血酸——>钼蓝
在该反应中形成的钼蓝的量与样品中存在的Pi的量成比例,并通过655nm处吸光度的增加来测量。根据使用已知磷浓度标准生成的校准曲线,Pi被量化为磷。
套件:
提供50次检测。试剂盒包含:
瓶1:缓冲液(25 mL,pH 5.5)和叠氮化钠(0.02%w/v)作为防腐剂。
在4°C下稳定2年以上。
瓶2:植酸酶悬浮液(1.2 mL)。在4°C下稳定2年以上。
瓶3:缓冲液(25 mL,pH 10.4),加MgCl2、ZnSO4和叠氮化钠(0.02%w/v)作为防腐剂。在4°C下稳定2年以上。
瓶4:碱性磷酸酶悬浮液(1.2 mL)。在4°C下稳定2年以上。
瓶5:磷标准溶液(24 mL,50μg/mL)和叠氮化钠(0.02%w/v)作为防腐剂。
在4°C下稳定2年以上。
瓶6:燕麦粉控制粉(5克;磷含量,见瓶身)。在室温下稳定>5年。
试剂溶液/悬浮液的制备:
1.使用随附的瓶子1中的内容物。在4°C下稳定2年以上。
2.使用随附的瓶子2的内容物。在第一次打开之前,摇动瓶子以去除可能沉积在橡胶塞上的任何酶。随后,将瓶子垂直存放。使用前,将瓶子旋转以混合内容物。在4°C下稳定2年以上。
3.使用提供的瓶子3中的内容物。在4°C下稳定2年以上。
4.使用随附的瓶子4中的内容物。在第一次打开之前,摇动瓶子以去除可能沉积在橡胶塞上的任何酶。随后,将瓶子垂直存放。使用前,将瓶子旋转以混合内容物。
在4°C下稳定2年以上。
5.使用提供的瓶子5中的内容物。在4°C下稳定2年以上。
6.为了在试验中使用燕麦粉对照,在标准测定程序的样品提取过程中,在20 mL盐酸(0.66 M)中提取1 g。在4°C下稳定1周。
注意:燕麦粉对照提取物预计产生的值在瓶子上提供的值的10%以内。燕麦粉对照提取物也可以在怀疑样品中的物质引起抑制的情况下直接用作穗。在这种情况下,在计算总磷[g/100g]时必须考虑燕麦粉对照释放的磷浓度。
概要:
植酸检测试剂盒是一种简单的方法,用于测量和分析食品和饲料样品中的植酸/总磷。该方法不需要通过阴离子交换色谱法纯化植酸,使其适用于大量样品。
规格:每个试剂盒50次测定
运输温度:环境温度
储存温度:短期稳定性:2-8°C,
长期稳定性:见单个组件标签
稳定性:在推荐的储存条件下>2年
分析物:植酸、磷
检测形式:分光光度计
检测方法:吸光度
波长(nm):655
信号响应:增加
线性范围:每次测定约0.5至约7.5µg磷
检测限:约11.3 mg磷(约40 mg植酸)
反应时间(分钟):酶法25分钟;1小时用于磷酸盐测定
应用实例:种子材料、饲料和食品。
方法识别:新方法