miRNA质粒载体

MicroRNA 表达载体构建

microRNA过表达载体

吉玛提供两种过表达的方式：

1. 从天然的基因组序列中表达pre-miRNA转录本构建pre-microRNA。插入序列不仅包含pre-miRNA茎环结构，同时构建100-200bp长的上下游两端的侧翼序列。使用使用pol-Ⅱ（如CMV）启动子，这种构建方式保证高水平的表达pre-microRNA。表达出来的pre-miRNA的生理活动尽可能接近天然状态。

使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息及指定过表达载体类型（如吉玛pEX系列 M核过表达载体ﻉ，我们完成序列合成，质粒构建。

2. 利用吉玛优化过的载体，模拟内源miRNA-155的表达模块，这种构建方法解决了不同miRNA表达效率差异的问题，同时也有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p，-5p的问题。miRNA的发夹序列融合在EGFP报告基因的后面，模拟miRNA在体内的成熟过程。

使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息，我们完成序列合成，质粒构建。

microRNA抑制子表达载体

吉玛提供两种miRNA抑制子载体构建的方式：

1. ;)PAN>利用吉玛优化过的载体，模拟内源miRNA-155的表达模块，来表达miRNA inhibitor序列。这种构建与吉玛miRNA过表达方式2使用同样的载体系统，方便客户使用同一套系统完成miRNA的过表达与抑制。

使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息，我们完成序列合成，质粒构建。

2. miRNA sponge（海绵）载体构建：吉玛通过构建载体，表达包含多个成熟miRNA结合位点的RNA序列，通过吸附结合成熟miRNA，从而抑制miRNA的作用，从而进行功能缺失性研究。

miRNA sponge的特点：

a. 由于miR Sponges是由质粒编码的，它能够通过真核表达载体或包装慢病毒颗粒达到稳定沉默细胞microRNA的目的；

b. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究；

c. 可以利用miR Sponges实现体内外loss of function研究；

d. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；

e. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。

使用这种构建方式，客户需提供miRNA的具体信息、预构建miRNA inhibitor的重复数及预构建inhibitor的序列信息，我们完成序列合成，质粒构建。

microRNA靶基因荧光素酶报告载体

吉玛采用Promega的psicheck2.0的载体系统完成靶基因3’ UTR质粒载体构建服务。可提供基于人、小鼠、大鼠基因的UTR构建。

psicheck2.0报告基因检测系统用来检测siRNA/miRNA与靶基因是否可能存在调控作用，该报告系统报告荧光(hRluc)，其下游构建了靶基因3’UTR区域，通过对该荧光的监测，即可验证siRNA/miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光(hluc) 作为稳定内参，用于监测质粒表达效率。

严格的实验体系，要求miRNA与mRNA 3’ UTR验证实验中需要构建靶mRNA的点突变载体，以验证靶点作用有效性。突变载体构建主要依据预测的miRNA与靶基因3’UTR的稳定结合区域(即种子区)。通过种子区全部碱基或部分碱基突变导致miRNA与靶基因3’UTR区域的结合能力大大降低，从而判断是否存在miRNA的调控作用。

完成miRNA靶基因报告基因载体构建，需要客户提供：miRNA具体信息，预测靶基因信息，miRNA与靶mRNA结合位点信息。

注：

a. 靶基因3’ UTR长度须小于500bp，否则价格及合成周期另计；

b. 单位点(即1个miRNA-mRNA作用位点) 突变价格如上，多位点突变价格及合成周期另计。

Lentivirus microRNA表达载体