精子细胞ATP生物发光法定量检测试剂盒

精子细胞ATP生物发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

精子细胞ATP生物发光法定量检测试剂是一种旨在通过萤火虫荧光素酶反应系统，荧光素在酶的催化下，与ATP发生反应，产生生物光能，采用冷光仪测定其相对冷光单位的变化，来定量分析精子细胞样品（包括裂解或悬液）中ATP浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种新鲜或冻存的精子细胞（动物、人体）的ATP检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。在精子细胞中，ATP与精子鞭毛（flagellum）启动的运动能力和速度有关。ATP水平用于评价精子细胞膜的完整性、线粒体功能、以及精子活力。萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的单体蛋白，催化ATP依赖性荧光素（luciferin）的氧化，经过电子转移，将化学能转化为氧化型荧光素（oxyluciferin）的光能，与ATP量成线性正相关，通过生物发光仪（560nm）检测，由此定量ATP浓度。其反应方式为：

luciferase

ATP  ＋ D-Luciferin ＋ O2  →  Oxyluciferin  ＋ AMP ＋ PPi  ＋ CO2  ＋ Light

            Mg²⁺

产品内容

清理液（Reagent A）  200毫升

裂解液（Reagent B）   60毫升

缓冲液（Reagent C）   2.5毫升

反应液（Reagent D）  250微升

标准液（Reagent E）  20微升

产品说明书      1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）和裂解液（Reagent B）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准液配制的容器

2毫升离心管：用于样品处理和保存的容器

培养箱：用于精子细胞孵育

血细胞计数器：用于精子细胞计数

测试管：用于发光检测用的专用试管

黑色96孔板：用于冷光检测操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品沉淀

化学发光仪：用于检测化学发光

实验步骤

实验开始前，从－20℃冰箱里取出试剂，置于室温下预热15分钟，避免光照；设置好冷光仪：温度22℃，1秒延时（Delay），1秒整合（Integration）检测。同时关上操作室的灯光。然后进行下列操作。

• 待测样品准备

• 移取2毫升新鲜收集（1小时内）的精液到2毫升离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混匀精子细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤5至7一次
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为 10⁶/毫升
• 煮沸3分钟
• 放进冰槽里静置2分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的2毫升离心管
• 放进冰槽里待测

• 标准样品准备

• 准备好8个无菌的1.5毫升离心管，标记为1至8号管
• 按下表分别加入适量的裂解液（Reagent B）到每个离心管
• 移取5微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀
• 小心移取50微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀
• 小心移取50微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀
• 小心移取50微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀
• 以此类推
• 将1至8号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

• 活性测定

测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的缓冲液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升离心管，加入50微升反应液（Reagent D），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液，放在暗室冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 准备1个黑色96孔酶标板，并做好标记：包括背景空对照孔，标准样品对照孔，以及待测样品孔 
• 分别加入50微升裂解液（Reagent B）、稀释的标准液（Reagent E）和待测样品
• 分别加入50微升反应工作液 
• 室温下（22℃），置于平式摇荡仪孵育2分钟，速度为50 RPM，避免光照
• 即刻放进冷光仪检测：1秒延时，1秒检测
• 获得相对发光单位（Relative Light Unit；RLU）：标准样品对照孔或待测样品孔RLU－背景空对照孔RLU
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对发光单位（RLU）；横座标（X轴）为标准ATP浓度（摩尔）
• 计算样品ATP浓度（纳或微摩尔/毫升或纳或微摩尔/10⁶精子细胞）：

【根据标准曲线计算所得样品ATP浓度（纳或微摩尔/升） X 样品稀释倍数】 

注意事项

• 本产品为50次操作
• 用户根据实际情况，选择5管标准区间范围
• 所有操作均须无菌状态下进行
• 操作时，须戴手套
• 建议检测精子细胞量为10⁶至10⁸；禽类动物的精子细胞量为10⁹
• 建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值
• 反应液（Reagent C）具有光高度敏感性，因此整个操作须避光进行，避免反复冻融
• 由于ATP无处不在，且热稳定性。建议使用的枪头、用具须严格无菌，避免重复使用；操作时避免污染试剂溶液，不得用手触摸试剂容器的内盖
• 如果用户没有冷光仪，可以使用闪烁探测器（scitillation counter 或β计数器）替代，但敏感性较低
• 如果样品ATP浓度较低，可以整合检测至10秒
• 如果是注射式冷光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射（injector）管道
• 冻存后的精子细胞ATP水平降低50％
• 本公司提供系列发育生物学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感