特别提示：包括pTG-T载体快速克隆试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：pTG-T载体快速克隆试剂盒
英文名称：pTG-T-vector Fast Cloning Kit
产品货号：WH0194
产品规格：20μl|60μl

本试剂盒中的Fast pTG-T载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，经由克隆质粒在XcmI内切酶酶切后得到的带3"T突出末端的线性化载体，通过该方法产生的带有3"T突出末端的线性化载体效率远高于传统酶切加尾法。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3"端添加一个A，可与Fast pTG-T载体3"端的T互补连接。

试剂盒中配备了新型的Rapid Ligation Mix（目录号：WH0193）为高效的T4 DNA连接酶反应试剂，其中含有连接增强剂、酶稳定剂，可大大缩短连接时间、提高PCR产物的连接和克隆效率。按不同需要配备了DH5α感受态细胞以及对照用超螺旋质粒，方便进行转化。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入（白色克隆为阳性重组克隆，蓝色的为载体自连的克隆，具体筛选原理参考分子克隆等书籍）。克隆后，可使用通用引物T7、SP6进行鉴定和测序。

产品特点：
·高效快速：5min快速连接，阳性率近100%。
·灵敏广泛：适合低至0.025pmol浓度片段和长至8 kb片段的高效连接。
·操作便捷：配合使用新型Rapid Ligation Mix，只需加入载体和片段即可进行连接反应。

试剂盒组成：

组分	WH0194-1	WH0194-2
Fast pTG-T-Vector	20μl	60μl
Rapid Ligation Mix（2×)	100μl	100μl×3
Control Insert DNA（688bp)（50ng/μl)	10μl	10μl
DH5α（100μl each)	100μl×10	100μl×30
Compcell Control Plasmid pUC19（0.1ng/μl)	10μl	10μl
ddH2O	1ml	1ml

保存条件：感受态细胞需要严格的在-70℃冻存，保质期6个月，其余的试剂可于-20℃保存1年，避免反复冻融。（载体和连接试剂可以适当的分装成小份，防止反复冻融，以保证质量）。

不同片段使用量：
载体与片段的摩尔比控制在1:3～1:10，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度和片段长度来计算其摩尔比。插入片段用量，可根据以下公式粗略计算：
插入片段用量ng=（3～10)×（插入片段长度/载体长度
)×载体用量ng
连接体系中50ng的载体，不同大小的PCR产物最佳加入量举例如下：

PCR产物长度	最佳的使用量
700bp	35ng
2000bp	100ng

反应体系：标准体系为10μl体积，5μl的反应体系也能取得很好的效果，试剂用量减半。

载体图谱：

多克隆位点图：


注意事项：
1．连接使用的PCR片段3"端应带有A末端，如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的平末端片段，可选用零背景快速克隆试剂盒（WH0191/WH0192）或Fast pTG-T平末端连接试剂盒（WH0213）进行连接反应。
2．转化过程中使用Control Insert DNA做对照是非常必要的，在实验出现问题时可以确定原因。
3．建议留下部分连接产物，在出现问题后能迅速的补救，减少不必要的重复实验。
4．涂布用量可根据具体实验作相应调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2 min）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。

使用方法：（以下的步骤请在无菌条件下操作)
1．按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分。

成分	使用量
Rapid Ligation Mix（2×)	5μl
Fast pTG-T-Vector（50ng/μl)	1μl
目的PCR片段/Control Insert DNA	Xμl/1μl
ddH2O	补足至10μl

2．轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂离心3-5 sec。将混合反应液置于室温（22℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
  注意1：如果插入片段长度小于1 kb，反应时间可以采用5min。
  注意2：如果插入片段长度为1-2 kb，反应时间可以采用5-10 min。
  注意3：如果插入片段长度为2 kb-3 kb，反应时间可以采用10-20 min;更长片段可采用30 min至过夜。
3．转化
①制备含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，至少预热20min。
②取部分连接产物加到50-100μl DH5α感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30 min（必要时请使用超螺旋质粒pUC19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将1 μl的Compcell Control Plasmid pUC19加入另一只感受态细胞管中作为对照，其余的操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。
③将离心管置于42℃水浴90 sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，期间不要摇动离心管。
④向离心管中加入350 μl 37℃预热的SOC或LB（不含抗生素）培养基，180 rpm、37℃振荡培养45-60 min。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏
⑤将离心管中的菌液混匀，吸取200 μl加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒或玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16h。
4．检测
①常规检测：将得到的白色菌落接种1-5ml LB（含有终浓度为50-100μg/ml的氨苄青霉素）培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
②快速检测：挑取白色菌落直接进行PCR检测或使用本公司重组菌落PCR鉴定试剂盒（WH0198）进行快速菌液鉴定。
③测序鉴定：使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。

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货号	名称	规格
BTN120514	即用型蓝白T载体D型(无RNA启动子，有MCS)	20次
BTN90407B	λDNA(不含N6-甲基腺嘌呤)	5μg
BTN140390	酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞	10×100μL
BTN120688	放线菌酮	1mL
BTN120692	硫酸庆大霉素	2mL
BTN131232	壮观霉素溶液	10mL
YT453	p53荧光素酶报告基因质粒(p53抑癌基因质粒)	1μg

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名称：DNA磷酸化试剂盒
货号：BTN130813
规格：20次
人工合成的PCR引物、linker和adaptor的5′端一般都是-OH基团而不是-PO4基团(除非额外付费要求在人工合成时加上-PO4基团)，而任何DNA连接酶都不能将一个DNA分子5′端的-OH基团和另一个DNA分子3′端的-OH基团进行连接，因此通过人工合成的DNA片段和天然DNA 之间的连接效率一般都比天然DNA 彼此的连接效率低(天然DNA 4个端口均可连接，人工合成的DNA跟天然DNA 有2个端口可以连接，人工合成的DNA之间没有任何端口可以连接)，尤其是在平末端连接时。本公司开发的DNA 磷酸化产品能将DNA分子5′端的-OH基团磷酸化。

产品特点：
1.可以快速把DNA的5′端的-OH基团变成-PO4基团，使人工合成的DNA(包括PCR产物)跟天然DNA一样有高的连接效率。
2. 既可以对单链DNA进行磷酸化处理，也可以对双链DNA片段同时磷酸化处理。
3.处理后的DNA可以直接用于连接反应、克隆等，不需要纯化。
4. 本产品足够20次DNA的磷酸化实验。
 

成分	规格
10×TPK缓冲液	50μl
ATP溶液(10mM)	100μl
T4 多核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期为6个月。

使用方法：

一：双链DNA片段(5′端为-OH基团的)的磷酸化
注意：如果是PCR产物，一定要先胶回收，不能使用没经过纯化的PCR反应液，因为其中的残留PCR引物会耗掉大量的激酶，降低PCR产物的磷酸化效率。
1、在微量离心管中配制下列反应液(20μL)：

成分	用量
PCR胶回收片段	2μL(不超过10pmol)
10×TPK缓冲液	2μl
ATP溶液(10mM)	5μl
T4 多核苷酸激酶(10U/μL)	1μl
超纯水到	20μl

2、37℃反应30分钟。
3、70℃热处理5分钟，灭活酶。
4、可直接用于后续克隆(加入量不要超过总体积的1/5)。

二：单链DNA片段的磷酸化
注：单链DNA 包括局部双链的DNA。引物，linker，adaptor，Oligo探针等均按此操作处理。
5、在微量离心管中配制下列反应液(20μL)：

成分	用量
单链DNA片段	5-10 pmol
10×TPK缓冲液	2μl
ATP溶液(10mM)	1μl
T4 多核苷酸激酶(10U/μL)	1μl
超纯水到	20μl

6、37℃反应30分钟。
7、70℃热处理5分钟，灭活激酶。
8、可直接用于后续克隆(加入量不要超过总体积的1/5)。如果使用浓度高，则可能需要乙醇沉淀法浓缩DNA。如果单链DNA的浓度低于5pmol，还需要在乙醇沉淀时加入核酸助沉剂。沉淀得到的DNA可溶解在适量的水中。

附：乙醇沉淀浓度DNA(本试剂盒不提供相关试剂，下列操作仅供参考：
1、在DNA溶液中加入0.1倍体积的3 M 乙酸钠溶液(pH5.2)。
2、再加入2.5倍体积的无水乙醇和4uL 核酸助沉剂。
3、混匀后12000g 4℃离心10分钟，小心弃上清。
4、加入1mL 70%乙醇，短暂离心3分钟后小心弃上清。
5、短暂离心5秒，吸弃残留液体(约30-50μL)。
6、室温放置2分钟干燥后加入适量的超纯水溶解DNA，立即使用或放-20℃长期保存。