microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)

特别提示：包括microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称：microRNA SYBR Green PCR Kit
产品货号：MTAXXXXX
产品规格：20μl×100次

microRNA荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green荧光染料)采用特异性的上下游引物对反转录所得microRNA的cDNA产物进行定量检测。不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，Biorab采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而极大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。该miRNA荧光定量PCR试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为MTAXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可下载SYBR Green miRNA qPCR kit列表查询。如果您研究的miRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。





产品组成：

组分	MTAXXXXX(100T)
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	1ml
50×ROX Reference Dye	200μl
microRNA Primer F（10μM）	100μl
microRNA Primer R（10μM）	100μl
microRNA 标准品(1pM)	100μl

储存：请置于-20℃，可保存2年；避免反复冻融。

操作方法：

1．按以下组分配制反转录反应液(反转录反应需购买我司的一步法microRNA反转录试剂盒)：

模板	microRNA	0.01-0.1μg
	Total RNA	0.1-2μg
4×One step miRNA RT Solution		5μl
10×miRNA RT Primer		2μl
Rnase-Free H2O		Up to 20μl

2．在PCR 仪上按以下条件进行反应:
  37℃——————60min
  95℃——————5分钟
3．获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。根据机型选择步骤A或B配制反应体系：
步骤A：需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
miRNA Primer F(10μM)	0.4μl
miRNA Primer R(10μM)	0.4μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。
步骤B：无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的RealTime PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
miRNA Primer F(10μM)	0.4μl
miRNA Primer R(10μM)	0.4μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。

4．进行 Real-Time PCR 反应，通常采用两步法，程序如下：

程序	温度	时间	循环数
Stage 1：	95℃	15分钟
Stage 2：	95℃	10s
	60℃	30s	35cycles
Stage 3：	Dissociation analysis

注意：使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子，过多的循环数会造成精确性降低。推荐的循环数为 30 个，在检测极低样品浓度时可将循环数调整到 35 个。

5．扩增结果分析和数据处理：
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。


6．标准品的使用
  该试剂盒配备的标准品为单链 DNA 分子，其与目标microRNA 分子反转录产物完全相同，因此可直接用于 PCR扩增，从而检测 PCR 体系的可靠性。其浓度为 1pM，通常20μl PCR 体系中加入1μl，可获得 Ct 值在15 左右的数据。除此外，可以使用TE Buffer 进行稀释，最低可稀释到0.01fM，用于标准曲线扩增或绝对定量试验。

常用内参miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)

货号	内参名称	适用物种
MTA01501	RNU6B	哺乳动物
MTA01502	RNU48	人
MTA01503	RNU44	人
MTA01504	SnoRNA135	鼠
MTA01505	SnoRNA202	鼠

根据您的关注的microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)，您可能还对以下产品有需求：


BTN131141 dNTP和引物清除剂 100次
BTN90708 即用型高保真PCR试剂盒 1.5mL
BTN130609 一步式RT-PCR Mix 1mL
YT383 PCR Master Mix (含绿色电泳染料) 400次|2000次10000次
WE0131 高效cDNA第一链合成试剂盒 100次
WE0140 实时荧光定量PCR预混体系(SYBR GreenⅠ) 5ml
ALH284 2.5mM dNTP混合溶液 1ml|5ml
ALH185 SYBR Green qPCR预混液 50μl×50次|50μl×200次

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名称：cDNA第二链合成试剂盒
货号：BTN131005
规格：30次
cDNA第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用DNA Polymerase I通过切口平移(nick translation)反应进行RNA链取代合成cDNA第二链。

产品特点：
1. 即开即用，含有合成cDNA第二链的所有试剂。
2. 所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。

试剂盒组成：

成分	规格
5×cDNA第二链合成缓冲液	480μl
20×cDNA第二链合成酶混合液	120μl
0.2 M EDTA溶液	120μl
超纯水	2ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
一、合成cDNA第一条链
本试剂盒不提供cDNA第一链合成试剂，用户需自备相关试剂合成cDNA第一链。
二、合成cDNA第二链
1.在冰浴上向已经完成合成cDNA第一条链的反应体系中依次加入下表试剂：

成分	用量
cDNA第一链合成反应液	10μl
超纯水	48μl
cDNA第二链合成缓冲液	16μl
cDNA第二链合成酶混合液	4μl
轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时
自备的T4 DNA聚合酶	2μl
轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟
0.2M EDTA溶液	4μl

注：如果不需要将双链cDNA平末端化，则可以跳过T4 DNA聚合酶处理步骤。
2.电泳5μl检测cDNA质量。如果cDNA在0.5-10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA或有其他异常，需查找原因后再继续。
3. 所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等实验。