两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)

特别提示：包括两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)
英文名称：SYBR Two-Step qRT-PCR UltraMix
产品货号：JN0052
产品规格： 50次RT+300次qPCR

  本试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用BalbScript All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix进行反转录，用BalbScript SYBR qRT-PCR UltraMix进行荧光定量。具有灵敏度高，合成能力强，扩增效率高的优点。
  本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

操作方法：
一、第一链cDNA合成
融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
1、按顺序加入下面的反应物

加入物	加入量
模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg)
PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	10μl
RNase Free Water	至20μl

2、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却。
3、轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。
4、70℃加热5min终止反应。
  反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。
二、实时定量
合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。
·用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus；其他仪器。
·用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 7500/7500 Fast；Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P；其他仪器。
·不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有：
Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4；Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；R℃he Applied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000；其他仪器。

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。

储存条件：-20℃

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名称：EDTA溶液
货号：BTN131181
规格：1mL
本产品是0.2M EDTA溶液，专用于终止各种需要镁离子的酶反应。

储存条件：低温运输和-20℃保存、有效期一年。

名称：长片段DNA快速高保真PCR MasterMix(含红色示踪染料)
货号：ALH610
规格：1ml|5ml
本产品包含高速高保真长片段DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×。使用时只需加入模板、引物，并补足水至Mix终浓度为1×即可。所含DNA聚合酶为多种采用最先进基因工程改造而来的超保真酶添加延伸因子混合而成，极大的提高了扩增长度、扩增速度、保真性和产量。本品是长片段超保真快速扩增的首选产品。本制品含红色示踪染料，不需添加上样缓冲液即可直接上样进行电泳；也可经过纯化处理，以用于酶切、连接、荧光测序等后续操作。

产品特点：
1. 扩增速度快：延伸速度可以达到3～4kb/min，是pfu的6～8倍。
2. 扩增产量高：一般PCR产物量比传统pfu产量高50%-100%。
3. 优异保真性：保真度是taq的54倍以上。一般随机挑一个菌测序便是正确无突变落。
4. 扩增长度长：以复杂基因组DNA为模板适合扩增不超过10kb左右的产物，以简单基因组、质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增不超过15kb左右的产物。

注意事项
1. 本系统扩增速度快，质粒和简单基因组等简单模板可以采用10～15秒/kb，复杂模板如人类基因组可以采用20～25秒/kb。
2. 如果电泳发现主带上下拖尾模糊现象，或者泳道出现从上样孔拖下来的涂抹带现象，一般提示延伸时间过长，梯度缩短延伸时间（建议10～15秒/kb为梯度减少延伸时间）直到获得满意结果。
3. 对于GC含量很高的模板，预变性和变性温度可以提高到98℃。本聚合酶耐热性强，98℃对本聚合酶的活性无改变。
4. 如果扩增模板GC含量高或者模板复杂扩增效果不佳时，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%～8%，按照1%梯度增加摸索最佳浓度。或者加入甜菜碱至终浓度1～1.7 M。并采用降落PCR（Touchdown PCR）。

储存条件：-20℃，有效期2年。

本制品别名：2×PCR MasterMix|长片段PCR MasterMix|高保真PCR MasterMix

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货号	名称	规格
YT378	2×PCR Master Mix（含Taq酶，buffer，dNTP）	400次
YT401	核酸酶/DNA清除剂(喷雾清除剂)	250ml
WE0123	高效热启动DNA聚合酶	500U|2500U
WE0128	高效cDNA第一链合成试剂盒(微量样本)	25次|100次
WE0155	BaldStar TaqMan Mixture(dUTP+UNG酶)(低含量ROX校正染料)	5ml
ALH264	荧光定量用第一链反转录预混合液	20μl×50次