2×RoomTop Taq PCR MasterMix

特别提示：包括2×RoomTop Taq PCR MasterMix在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：2×RoomTop Taq PCR MasterMix
产品货号：JN0035
产品规格：1ml×5

  本制品是以2×Taq PCR MasterMix为基础，与新型稳定剂整合后研发成功的预混试剂，具有极佳的保存稳定性，室温存放2个月，4℃存放6个月后，依然能保持极佳的扩增性能。2×RoomTop Taq PCR MasterMix保持了2×Taq PCR MasterMix试剂的特点，扩增长度可达8kb，能对4kb及其以下长度的片段进行高效地扩增。使用时只需加入模板和引物并稀释到一倍浓度即可进行PCR反应，大大地简化了操作过程，减少了 PCR操作过程中的污染。2×RoomTop Taq PCR MasterMix提供快速上样型（含高纯度蓝色染料）及不含染料的普通型两种形式供您选择。快速上样型在PCR反应完成后可直接电泳，节省时间。经测试，高纯度染料的加入不影响PCR反应。

产品特点：
1、可置于实验台上的PCR鉴定试剂。
2、室温存放2个月，4℃存放6个月，扩增性能不受影响。
3、可直接用于菌落、菌液等PCR鉴定实验。

产品用途：常规PCR鉴定；小片段DNA克隆；PCR产物加A。

使用建议：
1、使用本试剂扩增得到的PCR产物3′ 端有一突出"A"碱基，可直接克隆于 T载体中。
2、PCR反应液请在冰上配制，然后置于PCR仪上进行。这种冷启动法（Cool Start Method）可增加PCR扩增的特异性，得到良好的PCR结果。
3、使用PCR克隆目的片段时，为减少PCR过程中的随机突变，可适量增加模板量，减少PCR循环（如20至25次循环）。

应用实例：

图例一）在50μl 体系中，使用室温保存不同 时间后2×RoomTop Taq PCR Mix试剂对小鼠基因组1.6kb片段进行扩增
泳道M：DNA Ladder 2000 Plus
泳道1：0周 泳道2：2周
泳道3：4周 泳道4：6周
泳道5：8周 泳道6：10周

常用反应体系(50μl)：

组分	体积
2×PCR MasterMix*	25μl
上游引物	0.2-1.0μM(终浓度)
下游引物	0.2-1.0μM(终浓度)
模板	1-50ng（质粒）
	10ng-1μg(基因组)
ddH2O	至50μl
*Mg2+终浓度为2mM

常用PCR循环：

当扩增片段＜3K：
94℃	10分钟
30次循环	94℃，20秒 57℃ 20秒 72℃根据产物长度调整，60秒/kb
72℃	5分钟
4℃	保温
当扩增片段≥3K（推荐引物长度≥30bp）：
94℃	10分钟
30次循环	94℃，5秒 68℃ 根据产物长度调整，60秒/kb
72℃	5分钟
4℃	保温

PCR MasterMix选购指南：

编号	产品名称	特点
适用于菌落鉴定、菌液鉴定及常规PCR鉴定实验的Mix系列
JN0030	2×Taq PCR MasterMix	高性价比PCR Mix，使用简便，扩增灵敏度高
JN0034	2×Complex Taq PCR MasterMix	JN0030改进版，性能更均衡，适用面更广
JN0040	2×Fast Taq PCR MasterMix	最快速的PCR试剂，常规PCR鉴定45分钟内知道结果
JN0035	2×RoomTop Taq PCR MasterMix	可放在手边的PCR试剂，室温稳定存放60天
JN0036	2×RoomTop Fast Taq PCR MasterMix	室温稳定存放60天，高速PCR试剂，常规PCR鉴定45分钟内知道结果
适用于一些较难扩增的PCR条带的鉴定及短片段克隆
JN0032	2×Taq Plus PCR MasterMix	扩增效率更高及较好的保真度
JN0038	2×Hot Start Taq PCR MasterMix	采用热启动Taq，可获得很好的特异性
JN0041	2×Ultra Taq PCR MasterMix	高速扩增酶，优化配方，解决PCR扩增难题的，灵敏度高
高保真酶试剂，适用于长片段基因克隆
JN0031	2×Pfu PCR MasterMix	采用高保真酶，适用于基因克隆
JN0043	2×Fast Pfu PCR MasterMix	采用改良型高保真酶，更好的扩增效果，4倍扩增速度；扩增迅速
防止PCR产物二次污染、极高检测灵敏度的PCR试剂
JN0047	2×PCR MasterMix(防污染)	采用dUTP/UDG酶系统，从根本上杜绝PCR产物二次污染
JN0033	2×Genotyping PCR Kit（nomal）	极高检测灵敏度，可达到普通PCR试剂102至104倍扩增灵敏度

PCR MasterMix性能对比表：

名称	编号	扩增时间	扩增长度	是否有3"-A	基因组扩增
2×Taq PCR MasterMix	JN0030	1min/kb	≤8kb	√	+
2×RoomTop Taq PCR MasterMix	JN0035	1min/kb	≤8kb	√	++
2×Complex Taq PCR MasterMix	JN0034	1min/kb	≤8kb	√	+
2×Fast Taq PCR MasterMix	JN0040	15s/kb	≤8kb	√	+
2×RoomTop Fast Taq PCR MasterMix	JN0036	15s/kb	≤8kb	√	++
2×Ultra Taq PCR MasterMix	JN0041	15s/kb	≤8kb	√	+++
2×Taq Plus PCR MasterMix	JN0032	1min/kb	≤20kb	√	++++
2×Ultra Taq Plus PCR MasterMix	JN0042	15s/kb	≤30kb	√	++++
2×Hot Start Taq PCR MasterMix	JN0038	1min/kb	≤8kb	√	++++
2×Hot Start Taq Plus PCR MasterMix	JN0039	1min/kb	≤20kb	√	++++
2×Pfu PCR MasterMix	JN0031	1min/kb	≤6kb	×	+
2×Fast Pfu PCR MasterMix	JN0043	30min/kb	≤12kb	×	+
2×SYBR Green Realtime PCR MasterMix	JN0049	1min/kb	≤8kb	√	++
2×Genotyping PCR Kit（Normal）	JN0033	1min/kb	≤8kb	√	+++++
2×Genotyping PCR Kit（Fast）	JN0044	15s/kb	≤8kb	√	+++++
2×PCR MasterMix(防污染)	JN0047	1min/kb	≤8kb	√	+

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名称：PCR级海藻糖溶液
货号：BTN130506
规格：1.5mL
本产品为浓度为5M的海藻糖的水溶液，可以直接添加到PCR反应体系或逆转录反应中提高酶的热稳定性和活性。

产品特点：
1.在反应体系中加入海藻糖，可以增加热敏感的酶在高温下的稳定性和活性。
2. 海藻糖能增加鼠白血病病毒逆转录酶(Reverse Transcripatase)的热稳定和热激活特性，使其在60℃仍具有全部活性，足以在mRNA二级结构诱导终止反应之前合成全长的cDNA，反应效率大大提高。
3. 有助于提高干燥保存的酶的活性。

储存条件：低温运输，4℃保存，保存期一年

使用方法：按照1/3体积，将本产品加入到PCR体系中即可。

名称：T7体外转录试剂盒
货号：BTN91106
规格：50次
本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T7 RNA聚合酶	50μL
RNase-free水	1mL
说明书	1份

储存条件：-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、制备DNA模板(本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考)

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子一、制备DNA模板(本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考)

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
3)需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出(比如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。
4)必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板		如果使用质粒DNA,必须反复酚-氯fǎng抽提去除残留的RNase,然后再乙醇沉淀质粒DNA需室温时使用
PCR片段	50ng左右
质粒DNA	1μg左右
阳性对照	4μL
转录预配液，2×	10μL
T7 RNA聚合酶	1μL
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。
4. 取1-3μl电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

三、去除DNA模板(所需试剂可从本公司另购)
1.在体外转录体系中加入1μL自备的RNase-free DNase(3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯fǎng抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5. 加自备的200μL微量核酸沉淀剂(用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1、没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4、RNA长度比预计的长。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。

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