PE-Cy5抗体标记试剂盒

        Buccutite PE-Cy5抗体标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的最便捷方法。PE-Cy5是流式细胞术中常用的颜色。其主要吸收峰位于565nm，发射峰位于674nm。对于这种串联颜色，建议使用682/33 nm和695/40 nm的滤光片组。 AAT Bioquest提供这种Buccutite 快速标记试剂盒，以促进PE-Cy5串联结合抗体和其他蛋白质，如链霉抗生物素蛋白和其他二级试剂。 Buccutite PE-Cy5共轭试剂盒为您的抗体与PE结合提供了一种强大而方便的方法。该试剂盒包括预活化的PE和反应缓冲液。整个过程只需要两次简单的混合，无需进一步纯化。缀合的抗体可用于WB，ELISA和IHC应用。该试剂盒足以进行2次标记反应，每次反应最多25μg抗体。考虑到PE的大尺寸（240kDa），标记反应中使用的抗体量必须始终小于PE的量。任何新抗体试剂的最佳比例必须通过实验确定，但每50μgPE的25μgIgG抗体通常可获得最佳结果。我们的试剂盒提供预活化的PE-Cy5，以促进PE-Cy5串联结合抗体和其他蛋白质，如链霉抗生物素蛋白和其他二级试剂。我们的预活化PE-Cy5串联已准备好结合，产生比常规繁琐的基于SMCC的缀合化学高得多的产率。此外，我们的预活化PE-Cy5串联通过其蛋白质中丰富的氨基与蛋白质缀合，而SMCC化学靶向必须通过抗体还原而再生的硫醇基团。Buccutite PE-Cy5抗体标记试剂盒是美国AAT Bioquest研发的产品。

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实验方案

操作步骤

1.运行Antibody-Buccutite MTA反应

1.1将抗体溶液直接加入到Buccutite MTA（组分B）的小瓶中，并通过反复移液几次将其充分混合或将小瓶涡旋几秒钟。

1.2将抗体-Buccutite MTA反应混合物在室温下保持30-60分钟。 注意：如果需要，抗体-Buccutite MTA反应混合物可以旋转或摇动更长时间。

2.准备旋转柱用于抗体-Buccutite MTA纯化

2.1将提供的旋转柱（组分D）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并除去任何气泡。

2.2取下尖端并将色谱柱放入洗涤管（2 mL，未提供）中。取下盖子，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供）中，请立即离心。

2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。丢弃缓冲液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。丢弃缓冲液。

3.纯化抗体-Buccutite MTA溶液

3.1将柱（来自步骤准备旋转柱用于抗体-Buccutite MTA纯化）置于干净的收集管（1.5mL，未提供）中。 小心地将样品（~105μL，来自Step Antibody-Buccutite MTA反应）直接加载到色谱柱中心。

3.2加载样品后，加入5μL1XPBS（pH 7.2-7.4），使总体积为110μL。 将柱以1,000xg离心5-6分钟，并收集含有所需抗体-Buccutite MTA溶液的溶液。

4.制备抗体-PE缀合物

4.1通过向Buccutite FOL活化的PE（组分A）的小瓶中加入50μLddH2O制备Buccutite FOL活化的PE溶液，通过反复移液几次充分混合或将小瓶涡旋几秒钟。

4.2将整瓶Buccutite FOL活化的PE溶液混合到纯化的抗体-Buccutite MTA溶液（来自步骤纯化抗体-Buccutite MTA溶液）中，充分混合并在室温下旋转混合物1小时。

4.3抗体-PE结合物现在可以使用了。 注意：立即使用时，抗体-PE结合物需要用您选择的缓冲液稀释。 注意：对于长期储存，需要浓缩或冷冻干燥抗体-PE结合物溶液。

5.抗体-PE共轭物的储存

抗体缀合物应在载体抗体（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。 当在2mM叠氮化钠存在下储存并避光时，抗体-PE缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。 对于更长时间的储存，可以将抗体-PE缀合物冻干并在≤-20℃下储存。

6.离心注意事项

6.1旋转柱（组分D）可以装入2mL微量离心管或12×75mm试管中，用于在离心过程中收集样品。 使用2 mL微管和色谱柱进行初始色谱柱平衡步骤。

6.2能够产生1,000 x g的最小力的摆动式离心机适用于Bio-Spin柱。 在特定转速下产生的重力是微量离心机转子半径的函数。 有关从每分钟转数（RPM）到离心力或g力的转换信息，请参阅摆动式离心机说明手册。 或者，使用以下等式计算达到1,000 x g重力所需的RPM速度。

6.3RCF（xg）=（1.12 x 10-5）×（RPM）×2×r（RCF是相对离心力，r是从转子中心到Bio-Spin柱中间测量的以厘米为单位的半径 ，RPM是转子的速度）。