Amplite比色法总NAD/NADH检测试剂盒

        Amplite NAD+/NADH检测试剂盒（比色法）是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

        传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了生物样品引起的干扰。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。 

Amplite™比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，可在100μL检测体积（300 nM;图1）中检测少至30皮摩尔的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。

96孔板测定示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物（50μL）

添加NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟--2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：

3.1将10μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到990L PBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

注意：将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）可能由于NADH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于NAD / NADH比率测量，建议使用试剂盒15263。

注意3：对于基于细胞的NAD / NADH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（目录号20012）裂解细胞。

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在固体黑色96孔板中用Amplite™总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADH，而NADPH没有响应。