膜电位荧光探针DiBAC4(5)

      DiBAC4（5）是一种敏感的膜电位探针，具有更长的激发和发射波长。它是用于测量细胞膜电位的慢响应探针。通常，慢响应探针在跨膜分布中表现出电位依赖性变化，并伴有荧光变化。它们的光学响应幅度远远大于快速响应探针（通常每mV荧光变化1％）。慢响应探针，包括阳离子碳花青素，罗丹明和阴离子恶臭酚，适用于检测由呼吸活动，离子通道通透性，药物结合和其他因素引起的非兴奋性细胞的平均膜电位变化。

操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以40,000至80,000个细胞/孔/ 100 µL（对于96孔板）过夜，以10,000至20,000个细胞/孔/ 25 µL（对于384孔板）过夜。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以125,000至250,000个细胞/孔/ 100 µL 的浓度悬浮在等量的HHBS和MP染料上样溶液中（请参阅下面的步骤2.2），持续96-以及聚赖氨酸d板或30,000至60,000个细胞/孔/25μL的用于384孔聚赖氨酸d板。实验前将板以800 rpm的速度离心2分钟，并关闭制动器。

2.准备DiSBAC2（3）染料加载溶液：

2.1准备10至30 mM的DiSBAC2（3）的高品质无水DMSO 储备溶液。储备溶液应及时使用；任何剩余的溶液都需要等分并在< -20 ^o C 冷冻。

注意：避免重复的冻融循环，并避光。

2.2准备一个2X 的DiSBAC 2（3）染料加载 溶液： 在实验的当天，无论是溶解的DiSBAC 2（3） 固体在DMSO或解冻的等分试样的DiSBAC 2（3）的储备溶液至室温。用0.04％的制备的在Hanks（HHBS）20至40μM和20mM Hepes缓冲液，pH为7的2X工作溶液到0.08％的Pluronic ® F-127（目录＃20053）和2mM 锥虫红加 （目录＃2456），将它们混合均匀。该工作溶液在室温下至少稳定2小时。

3.运行膜电位测定：

3.1将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的DiSBAC2（3）染料加载溶液（来自步骤2.2）添加到细胞板中。

注1：如果您的筛选化合物干扰了g 培养基和血清因子，则在添加DiSBAC2（3）上染 溶液之前，用等体积的HHBS缓冲液替换生长培养基。或者，细胞可以在无血清条件下生长。

注2：上色后请勿清洗细胞。

3.2将染料加载板在细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意：在某些情况下，在室温下孵育30至60分钟可能会更好。

3.3使用HHBS或所需的缓冲液制备复合板。

3.4通过监测Ex / Em = 540/590 nm（目录号21414）的荧光强度进行膜电位测定。

注意：在实验之前进行信号测试非常重要。不同的仪器具有各自的强度范围。将信号测试强度调整为最大仪器强度计数的10％到15％的水平。例如，FLIPR-384的最大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置，使其信号测试强度约为7,000至10,000。