慢病毒

一 慢病毒产品介绍
      慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的病毒载体。慢病毒可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到被感染细胞基因组，进行长时间的稳定表达，是导入外源基因的有力工具。目前，慢病毒产品已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰等研究以及活体动物实验中。

1.1过表达慢病毒
      根据客户提供的基因信息，合成目的基因的cDNA序列，并将其连接到慢病毒载体上，通过包装获得目的基因的过表达慢病毒。

1.2干扰慢病毒
“三保一”干扰慢病毒
       根据客户提供的基因信息，设计并合成3条针对目的基因的shRNA模板，分别连接到慢病毒载体上，通过包装获得3个干扰目的基因的慢病毒株，以此达到确保至少1条能够达到有效干扰目的基因表达的目的。包装完成后提供全部3种干扰慢病毒。

定制靶点干扰慢病毒
       根据客户提供的基因信息和确定的干扰序列，设计和合成1条针对干扰序列的shRNA模板并将其连接到慢病毒载体上，通过包装获得目的基因的干扰慢病毒。
 
1.3 三保一”Cas9敲除慢病毒
 
       利用sgRNA来识别靶基因序列，核酸内切酶Cas9切断靶基因后细胞会通过NHEJ机制在断裂处结合，结合过程中随机插入N碱基，若插入的N碱基数恰好不是3的倍数，则目的基因发生移码突变，实现基因敲除。与RNA 干扰相比不同之处在于，Cas9 是从基因组水平对基因进行敲除，让靶蛋白完全失活。

      根据客户提供的基因信息，针对靶基因设计三个sgRNA，保证至少有一个可敲除成功，可选择Cas9和sgRNA是否在同一骨架上。
注：Cas9蛋白基因序列长达4kb，为保证病毒滴度，建议选择Cas9和sgRNA分开包装。
 
二 慢病毒产品优势 
      表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选。
      安全性高：未发现致病性，已被用于CAR-T治疗作用于人体。
      免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。
 
三 慢病毒常用载体

调控方式	常用载体	其他用途
过表达慢病毒	pLVX-IRES-Zsgreen1Amp+	哺乳动物细胞表达载体/双顺反子载体/荧光报告载体
	pLVX-IRES-PuroAmp+	哺乳动物细胞表达载体
	PLVX-puroAmp+	哺乳动物细胞慢病毒表达载体
	PLVX-IRES-mcherryAmp+	哺乳动物细胞表达载体/双顺反子载体/荧光报告载体
	PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-PuroAmp+	cDNA表达载体/双启动子载体
	PCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-PuroAmp+	cDNA表达载体/双启动子载体
	pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPAmp+	/
干扰慢病毒	Plko.1-EGFP-PUROAmp+	shRNA表达载体
	PLVX-ShRNA1Amp+	shRNA表达载体
	pLKO.1-puroAmp+	shRNA表达载体
	pLVX-shRNA2-Luc-Puro	shRNA表达载体

四 客户提供（订单信息表）
目的基因：名称、物种、Accession No
目的细胞：名称、培养条件
携带标签：如GFP/RFP/PURO等

五 擎科交付

服务项目	交付
过表达慢病毒	慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	对照慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	实验报告1份
“三保一”干扰慢病毒	不同位点干扰慢病毒各5支，共15支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	对照慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	实验报告1份
定制干扰慢病毒	慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	对照慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	实验报告1份
“三保一”Cas9敲除慢病毒	不同位点敲除慢病毒各5支，共15支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	对照慢病毒5支，200μl/支，（滴度＞1*108TU/ml)
	实验报告1份

 
产品使用注意事项
l 慢病毒的储存：短时间内使用可将慢病毒暂时放置于4℃保存（请尽量在三天内用完），如需长期保存需放置于-80℃，可储存6个月以上。如病毒存储时间超过6个月，在使用前需重新滴定病毒滴度。
l 反复冻融会降低病毒滴度，每次冻融会降低病毒滴度10%，为避免反复冻融建议按照使用量对病毒进行分装。

六 应用案例
6.1干扰慢病毒应用案例
      为了研究树突状细胞（DC）是否对逆转录病毒传递的siRNA定向基因沉默敏感，研究者在白光和荧光显微镜下检测了转基因小鼠体内感染的干扰慢病毒slGFP1和空载体DC表达情况，结果显示slGFP1表达下调。案列引用自文献 “Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells” 请点击下方链接查看详细内容http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/rna.2192803.
 
6.2过表达慢病毒应用案例
       SIVA-1在诱导多种不同细胞系凋亡中发挥关键作用，并参与了顺铂（DDP）介导的抗肿瘤作用机制。为探讨SIVA-1对DDP耐药的影响，构建重组pGV358-GFP-SIVA-1过表达慢病毒载体，转染人顺铂耐药胃癌细胞MKN45/DDP。菌落形成实验清楚地显示，SIVA-1过表达后细胞生长和增殖明显受到抑制。案列引用自文献“Lentivirus-Mediated Overexpression of SIVA-1 Reverses Cisplatin Resistance in Gastric Cancer in vitro”请点击下方链接查看详细内容https://doi.org/10.1007/s12013-020-00929-y
 
参考文献
Tiscornia G; Singer O, Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors.Nat Protoc.2006;1(1):241-5.
Sena-Esteves M, Tebbets JC, Steffens s, Crombleholme T,Flake AW. Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J Virol Methods 2004; 122:131-139.
Reiser J.Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.Gene Ther. 2000 ;7(11):910-3.
孟凡荣, 陈琛, 万海粟, et al. 慢病毒载体及其研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2014(12):870-876.
 
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