病毒RNA抽提试剂盒(离心柱式)

离心柱式RNAeasy™病毒RNA抽提试剂盒(RNAeasy™ Viral RNA Isolation Kit with Spin Column)是一种基于离心柱法从含病毒的血浆、血清、体液、拭子及细胞及其培养上清、组织等样品中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地抽提长度大于200个核苷酸(nucleotide, nt)的病毒RNA的试剂盒。抽提获得的大于200个核苷酸的病毒RNA样品(可能同时含有样品中的其它RNA)可以用于各种常规用途。

本试剂盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反转录、RT-PCR、qPCR、Northern、点杂交(Dot Blot)、纯化mRNA、体外翻译、RNase protection assay、cDNA克隆等下游实验；也可用于基因表达芯片分析(microarray)、高通量测序(high throughput sequencing)等对RNA质量要求较高的情况。

本试剂盒抽提病毒RNA的基本流程如图1所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后让RNA特异性地结合到纯化柱上，而蛋白质等其它组分通过高速离心被有效去除，再通过3次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来。

图1.离心柱式病毒RNA抽提流程示意图

本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行病毒RNA分离纯化，能有效避免传统的Trizol法抽提时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。

本试剂盒使用快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的病毒RNA沉淀步骤，抽提操作过程仅15-20分钟。相比于传统的Trizol抽提法，本试剂盒的操作流程显著简化，缩短了抽提时间，降低了病毒RNA被降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。

本试剂盒适用于含病毒的血浆、血清、体液、拭子及细胞及其培养上清、组织等样品中病毒RNA的抽提，为提高病毒RNA的提取量，建议自备carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在纯化过程中与纯化柱的结合效率和洗脱效率；另一方面可以降低被可能存在的痕量残留RNase降解的风险。Carrier RNA在病毒含量较少的情况下效果更为明显。Carrier RNA推荐购买RNA (病毒RNA等抽提用)。

本试剂盒小包装R0035S可用于12个样品的RNA抽提，中包装R0035M可用于50个样品的RNA抽提，大包装R0035L可用于200个样品的RNA抽提。

室温保存，一年有效。

如果样品中含有细胞或组织，不影响病毒RNA的抽提，但须注意抽提获得的病毒RNA中包含细胞或组织的RNA。

为提高病毒RNA的提取量，推荐使用Carrier RNA (病毒RNA等抽提用) 或自备carrier RNA。

本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。

对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用生产的RNase and DNase Away 以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

使用冻存的样品抽提RNA的效果通常比新鲜的样品差一些。因为在样品冻融过程中一些RNase会被释放出来并消化样品中的RNA，建议尽量避免冻融。对于病毒样品，推荐使用生产的病毒RNA稳定保存液进行保存以保证样品RNA的完整性。

本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。

废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。

结合液、洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.样品的准备。
a.液体样品的准备。
含病毒的血浆、血清、无细胞体液、拭子、细胞培养上清等样品，按照常规方法取样。每100µl液体样品加入300µl裂解液。轻轻颠倒混匀3-5次。
选做：为提高病毒RNA的提取量，建议在不含或含很少细胞或者组织的样品中加入carrier RNA。推荐使用Carrier RNA (病毒RNA等抽提用)，或使用下面方法提取：取任意新鲜的细胞或组织，用抽提试剂盒(推荐动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)或Trizol法提取RNA ，作为carrier RNA。每个病毒样品需要2-5µg carrier RNA，直接添加至裂解液中即可。
b.细胞样品的准备。
收集50-100万左右带有病毒的细胞。对于悬浮细胞，1000-2000×g离心1分钟后弃上清，加入300μl裂解液，轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μl裂解液，轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
c.组织样品的准备。
取15-20mg带有病毒的动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μl裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中，迅速加入600μl冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8-10次，室温放置3-5分钟。然后约14,000×g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
注意：细胞的数量一般不超过500万，不超过100万细胞宜使用300μl裂解液，多于100万细胞宜使用600μl裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg，用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后，离心管下部可能会有一些胶状物质，宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物，会导致得率下降约30-50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
2.加入等体积(指病毒样品和裂解液的总体积)结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
3.将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内，12,000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
注意：当裂解液的体积大于300µl时，在加入等体积结合液后，总体积会超过纯化柱的容量，这时应分成2次过柱，即将一半的混合物过柱后，再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1-2分钟，或者加大离心力至16,000×g。对于一些能快速启动达到12,000×g的离心机，离心30秒已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
4.加入600µl洗涤液I，12,000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
5.加入600µl洗涤液II，12,000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
6.重复步骤5一次。
7.最高速(约14,000-16,000×g)离心2分钟，去除残留的液体。
8.将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入30-50µl洗脱液，室温放置2-3分钟，最高速离心30秒，所得溶液即为纯化的病毒RNA样品。样品病毒RNA提取量可能会较少，用紫外分光光度计较难测出，建议用qRT-PCR法检测(推荐使用Probe One-Step qPCR Mix或者SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit)。不同数量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的病毒样品常规保存液中，用本试剂盒提取病毒后使用新型冠状病毒(2019-nCoV)双荧光qRT-PCR试剂盒进行检测，此处的病毒量为每个PCR反应体系中病毒的IU数。

注意：洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20µl，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。