光片显微镜（大样品成像系统）—LSM

光片显微镜（大样品组织器官成像系统）—LSM
类器官3D成像系统
 
       传统显微镜的小范围的成像并不能完全反映组织的生物学状态，而采用传统的连续切片法又很容易导致样品扭曲变形。因此迫切需要一种能够实现大样品块、快速扫描、深度成像、高分辨率3D动态图像输出的荧光显微镜。而光片显微成像系统满足了科研人员的这种需求。
光片显微镜系统用于细胞水平、透明化处理后脑、小鼠胚胎、组织、器官的大样品整体成像或者斑马鱼等活样品成像；在细胞凋亡、细胞周期、细胞毒作用、受体蛋白转位、蛋白相互作用等许多方面都有很好的应用，可用于细胞生物学，系统生物学，类器官培养后的评估以及肿瘤学等研究。 功能用途：光片显微成像系统应用范围十分广,可用于透明化处理后脑、小鼠胚胎或者器官，包括骨骼、脊髓、软骨以及四肢等大样品整体成像或者斑马鱼活样品成像。
借助于光片照明显微镜，发育学家可以观察到动物和人类胚胎模型各个阶段的组织状态，神经学家能够轻松的研究神经元的再生能力并探究新的神经传导途径，肿瘤学家可以准确的筛选血管抑制剂类药物，免疫学家能够研究淋巴系统整体的发育过程。光片显微成像系统除了可以观察透明化的样品外，还可以实现动物的体内成像。对于表达内源性荧光蛋白或者标记了荧光抗体的组织也可以快速便捷地成像。
 

     
 
光片显微镜—LSM的系统化服务方案包括专业化的硬件、专业化的软件、透明化方案、技术服务
适用于各种水性和有机透明剂处理后的样品成像，同时适用于各种自然透明模式生物的成像；
支持各种折射率的透明剂，可软件设定透明剂折射率以使所用光片与透明剂折射率相匹配，包括水及所有透明试剂（/cubic/scale/TDE/ClearT/Clarity/SeeDB/BABB/THF-DBE/Fruit等）；
 

 

 
适合样品尺寸范围为5μm到2 cm，视野范围从6 mm至87 mm；
样品池电动行程：2cm x 2cm x 2cm (X - Y - Z)； 可对大尺寸样品进行单细胞分辨率的深层成像，可观察超厚样品，成像深度可达2 cm，最大成像尺寸约为2 cm X 2cm X 2 cm；
采用2光片照明方式，光片厚度约为2.7微米到24微米可调，具有极低的光漂白与光毒性； 
采用双侧光片照明方式，可以最大程度消除图像中的阴影；
 

 
光片水平方向可自动调整聚焦点位置，支持动态水平对焦功能，以保证大样品成像时图像各处都能达到最佳的成像质量（包括手动移动光片，自动步进式移动光片，自动连续移动光片）；
采用多波长激光器，标配405nm，488nm， 532nm,  633nm ，其他波段可选，最多可同时配置6个波长；
可配备0.63X齐焦电动变倍体，具备0.63X~6.3X光学连续变倍体，整套设备的放大倍数为1.26X~12.6X；
可配备0.63X，1X，2X物镜；
可配备高分辨率多浸成像模块，10X物镜（NA 0.5，工作距离5.5mm，）， 20X的定倍物镜（NA 1.0， 工作距离8.2mm）；
 

 
高分辨率相机：sCMOS，分辨率为2048 x 2048，最高帧速100 fps@全幅分辨率，用于快速功能成像；
配套有自主开发的LSM-Image软件，实现所有硬件控制、图像获取及3D重构；
LSM-Analysis软件可实现数据获取与处理，并控制所有硬件，进行成像控制及光片照明控制。支持多通道快速切换；
支持多视场自动成像拼接，Z-stack，时间序列（含XYZT）成像，多维(x, y, z, t, λ)数据堆栈与分析。
 

 
光片显微镜样品处理-组织透明化技术
如今，组织样品的透明化已经成为神经生物学和发育生物学等研究领域中的核心技术手段。
为什么要进行组织透明化处理？
传统的成像技术在观察大型生物样品时，一般采用连续切片法，然后将组织的切片置于显微镜下观察，最后通过软件将图像进行整合形成立体影像图。然而这种连续切片的方法很容易破坏组织的原有形态，对组织造成不规则的扭曲，导致不可逆的破坏。那么如何才能避免光的散射、吸收以及发射造成的影响从而获得真实的全组织三维图像呢？组织透明化技术的出现非常好的解决了这些问题。“clearing-透明化”这一概念最早由Werner Spalteholz 在1911年进行了详细的阐述。他开发出了最早的组织透明化方法之一：用甲基水杨酸酯/苯甲酸苯甲酯（5:3）混合液对组织进行透明化处理，而当时也有学者使用含有丁香油或者二甲苯的香脂来做透明化处理。随着技术的发展，现有的组织透明化处理的方案大约有30多种，主要分为两类：基于水溶性缓冲液的方案和基于有机溶剂的方案。
一、基于水溶性缓冲液的组织透明化方案：
水溶性缓冲液的组织透明化方案有很多种，根据原理又可以分为三类：水凝胶法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

（1）水凝胶法
CLARITY技术、PACT &PARS技术、SE-CLARITY技术、SWITCH技术、EDC-CLARITY技术和ACT-PRESTO 技术可归为水凝胶法。
（2）水化法
水化法的主要代表是CUBIC技术，使用尿素、氨基醇类等多种试剂的混合液对组织进行浸泡处理，能够实现对小鼠脑甚至整个小鼠的透明化。
（3）浸入法
SeeDB技术 和FRUIT技术属于浸入法，其共同点在于使用高浓度的果糖浸泡后，组织可以变得透明。然而在成年动物或者致密的组织中，经过浸泡处理可能会增加成像背景并降低透明度。
二、基于有机溶剂的组织透明化方案：
水溶性缓冲液的组织透明化方案有很多种，根据原理又可以分为三类：水凝胶法（hydrogel）、水化法（hyperhydration）和浸入法（immersion）。

基于水溶性缓冲液的组织透明化方案成本比较高而且费时费力，同时由于解聚化试剂的使用使得组织明显膨胀，在某些情况下由于组织的不透明性甚至会阻碍处理的程序。而基于有机溶剂的组织透明化方案能够弥补这些不足。基于有机溶剂的组织透明化方案在几个小时之内就可以完成组织的初步透明化。而针对那些比较致密和比较大型的组织，比如成年动物的肿瘤或者器官可以在两天内完成透明化。而且有机溶剂透明化方案花费也比较少，一般在几美金左右。基于有机溶剂的组织透明化方案主要为两步：第一步脱水，第二步透明，最终的折射率达到1.33。最初由Spalteholz发展的透明方法经过修正和优化之后很快就成为标准的方法。使用甲基水杨酸酯/苯甲酸苯甲酯、BBAB消除内源性的荧光，德国科学家Dodt建立的3DISCO 技术能够将内源性荧光保留一段时间。Dodt也一直在研究更加稳定的DISCO (sDISCO)，以期延长内源性荧光保留时间。2013年，Alain Chédotal 改进了3DISCO技术，他认为：“3DISCO技术应该和免疫荧光染色一样，经过改进就能够实现对大组织样品的全标本染色”。2014年Jean-François Brunet将这个技术发表在Science杂志上。Chédotal 实验室的Nicolas Renier在此基础上又进行了完善，命名为iDISCO技术。
之后他又发明了iDISCO+技术，Nicolas Renier解释了iDISCO+技术的优势：“采用比较温和的办法，尽可能地兼顾了提高透明度（需要剧烈处理以去除脂肪）和保留蛋白质内源性荧光（需要温和处理组织）。采用iDISCO+技术，不仅能够达到类似3DISCO水平的透明度，而且保留了更多的内源性萤光信号，最终我们可以同时获得偶联的荧光素信号和有机溶液中的脂质提取物”。iDISCO技术可以将微弱的内源性萤光信号进行免疫标记，最终增强放大。 其他的有机溶剂的组织透明化方案比如FluoClearBABB 技术[17], uDISCO技术[18], 和ECi技术也能够达到保留内源性荧光的效果。uDISCO技术具有更强的收缩样品能力，可以轻松实现大样品——比如整个小鼠的成像。而针对某些不适合剧烈收缩的样品，无毒性的ECi技术能够实现更好的成像，ECi技术甚至能够将骨骼进行透明化从而实现对骨髓的成像。Visikol HISTO是一种商品化的可逆且无损的有机透明剂，可以实现对样品的三维成像，随后样品还可以进行组织学的其他处理。

总结： 优于透明化会改变样品本身的性质，所以处理过程通常都会引入一定的人造假象，所以针对特定的样品，需要对特定的方法进行一定的优化。相比较两类不同的透明化方案，3DISCO技术和ECi技术耗时短、花费少。相对于sDISCO技术、uDISCO技术和ECi技术，CLARITY技术和CUBIC技术虽然能够较好的保留内源性荧光、达到良好的透明化效果，但是保留时间短、花费高也限制了其使用。对于大型组织样品的深度成像，经过远红外染料如Cy7和Alexa790标记后，采用iDISCO技术能够得到十分出色的成像效果。而此时一般不适合用DAPI进行染核，而改用TO-PRO-3。采用标准的脱水方法（先用乙醇然后再用甲醇）可以避免样品收缩，降低成像背景。
 
光片显微镜的应用领域
1、发育生物学： 光片显微镜可用于斑马鱼，哺乳动物胚胎的成像。
   
2、肿瘤学：光片显微镜可用于于肿瘤模型等样品的成像。
恶性肿瘤的发生通常伴有血脑屏障的损坏，导致大分子物质可以通过血脑屏障达到肿瘤处，然而使肿瘤处的药物达到最佳浓度仍是脑瘤治疗的难题，需要对肿瘤处的药物活性进行研究。光片显微镜能够实现脑瘤中的抗体聚集和药效性的量化，用于评估中枢神经系统靶向药物。
        
3、神经生物学：光片显微镜可用于于脑组织等样品的成像。
当研究小鼠脑部同时需要保留其3D结构时，则需要对脑做组织透明。3DISCO是一种非常简单的组织透明化技术，经常用于表达GFP的转基因鼠脑组织。3DISCO技 术在与光片显微技术结合后可以快速地生成轴突束的三维图像。然而，像GFP的荧光在透明化后会迅速地消失。尽管有多种组织透明化技术可很好地保持荧光强 度，这些方法往往很复杂，耗时长达数天甚至数周，而且适用范围较小。经过试验，在对脑组织进行免疫染色后再进行3DISCO透明化，可以使荧光染料保持活性长达数月，并同时保证了实验效率。有报道，研究人员使用了光片显微镜和共聚焦显微镜。光片显微镜使用单侧光源对后屈束和松果体缰成像仅用了10分钟；使用双侧光源对全脑成像仅用时1小时。而共聚焦显微镜仅对后屈束成像就使用了4小时。使用光片显微镜显著提高了成像速度。
   
 
4、疾病模型：光片显微镜可用于于疫病相关的组织器官等样品的成像。
中枢神经系统在能量代谢中发挥着重要的作用；当这样的神经调控机制出现问题时会使得能量代谢失去平衡，产生肥胖、二型糖尿病或其他的失调现象。白色脂肪组织是机体代谢平衡调节的重要组成部分。机体生理状态下，以脂肪形式存储和释放能量，维持代谢稳态。白色脂肪组织在生理和病理条件下发生显著变化，对整体的代谢稳态和系统性炎症产生广泛影响，深入了解其调控机制对于理解和治疗肥胖症、2型糖尿病等代谢类疾病有着重要指导意义。研究显示，在低温条件下，白色脂肪组织发生明显的细胞及分子水平变化，高表达Ucp1蛋白的细胞类型数目明显增多，而该类细胞被认为在调节代谢平衡中发挥重要功能。在该报道的研究中发现，白色脂肪组织中分布高密度的交感神经纤维，并且低温条件刺激激活交感神经元，其活动对白色脂肪组织在低温刺激下的棕化反应有重要促进功能，揭示了白色脂肪组织受神经活动调控的重要生理基础。
   
 
5、药学和药效：光片显微镜可用于对肿瘤的重要指标（血管数量、容量、分支）的自动量化；对于治疗药物的运输能力和穿透性（体现为肿瘤生长、血管生成、转移）的的成像。
   
 
光片显微镜LSM的技术参数

激发光片	照明光束	单向双向可选
	光片数量	2
	光片厚度	2.7μm - 24μm可调
	光片宽度	6mm
	光片水平对焦方式	动态可调
	适用折射率范围	1.33 - 1.56
常规分辨率光学检测	变倍体	齐焦电动变倍体
		0.63x - 6.3x (1:10)
	物镜	2x	1X		0.63X
		0.5	0.25		0.15
		1.7 - 17.6	3.4 – 35.2		2.7 - 28
		1.26x - 12.6x	0.63 x -6.3x		0.4x - 4x
		20mm	65mm		87mm
	彩色检测	6位或8位滤波轮过滤器
	彩色校准	Dynamic动态400nm - 850nm
高倍率高分辨光学检测	多浸物镜	10x		20x
	数值孔径	0.5		1.0
	总放大倍率（物镜+成像透镜）	10x，5X		20x，10x
	工作距离	6mm		8mm
	适用折射率范围	1.33 - 1.52		1.44-1.52
	彩色检测	6位或8位滤波轮过滤器
	彩色校准	Dynamic动态400nm - 850nm
探测器	类型	sCMOS
	像素	2048 x 2048
	像素大小	6.5μm x 6.5μm
	最大帧率	100fps@全帧
	噪音读取	0.3 e-@0℃
成像室	成像解决方案	水及所有透明试剂
	样品行程范围（X,Y,Z）	2厘米X 2厘米X 2厘米
	样品大小	5μm至2cm
光源	激光模块	最多6条激光线，每个二极管50mW - 100mW，波长可选，标配405nm，488nm，532nm，633nm
尺寸	55cm x 70cm x 60cm(W x H x D)
重量	70kg

 
 
 
北京佰司特贸易有限责任公司 (https://www.best-sciences.com)：
类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC；单分子质量光度计-TwoMP；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA；光片显微镜-LSM-200；超高速食品级原子力显微镜-HS-AFM；蛋白质稳定性分析仪-PSA-16；全自动半导体式细胞计数仪-SOL COUNT；蓝光/绿光LED凝胶成像；台式原子力显微镜-ACST-AFM；微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000；