Temsirolimus | 替西罗莫司

MCE 国际站：Temsirolimus

中文名：替西罗莫司

CAS：162635-04-3

品牌：MedChemExpress (MCE)

存储条件：4°C, protect from light, stored under nitrogen

生物活性：Temsirolimus 是 mTOR 的抑制剂，IC₅₀ 为 1.76 μM。 Temsirolimus 在动物模型中激活自噬 并防止心脏功能恶化^[8]。 IC50 和靶标：IC50：1.76 μM (mTOR) 体外替西罗莫司有效抑制 mTOR 激酶活性，IC₅₀ 为 1.76 μM，类似于在不存在 FKBP12 的情况下，雷帕霉素的 IC₅₀ 为 1.74 μM。 Temsirolimus（10 nM 至 <5 μM）通过 FKBP12 依赖性机制显示适度和选择性的抗增殖活性，但可以在低微摩尔浓度（5-15 μM）下完全抑制大量肿瘤细胞的增殖，涉及 FKBP12 非依赖性抑制 mTOR 信号。微摩尔而不是纳摩尔浓度 (20 μM) 的替西罗莫司处理导致整体蛋白质合成和多核糖体分解的显着下降，同时翻译延伸因子 eEF2 和翻译起始因子 eIF2A 的磷酸化迅速增加^{[1]< /sup>.?Temsirolimus 抑制核糖体蛋白 S6 的磷酸化，在 PTEN 阳性 DU145 细胞中比在 PTEN 阴性 PC-3 细胞中更有效，并以浓度依赖性方式抑制两种细胞的细胞生长和克隆形成存活[2].?Temsirolimus (100 ng/mL) 有效抑制原代人淋巴细胞白血病 (ALL) 细胞的增殖并诱导细胞凋亡[3]。 体内 CCI-779（20 mg/kg，腹腔注射）抑制两种前列腺癌异种移植物的生长，PC-3 肿瘤的生长在一定剂量下受到抑制-依赖性方式和生长抑制大于 DU145 肿瘤[2]。在具有人类 ALL 的 NOD/SCID 异种移植模型中，坦西罗莫司以 10 mg/kg/天的剂量进行治疗可减少外周血母细胞和脾肿大[3]。?给予坦西罗莫司（20 mg/kg , ip 5 天/周）与对照组相比，DAOY 异种移植物的生长在 1 周后显着延迟 160%，在 2 周后延迟 240%。单次大剂量 Temsirolimus (100 mg/kg, ip) 治疗可在 1 周内诱导 37% 的肿瘤体积消退。 Temsirolimus 治疗 2 周还将抗雷帕霉素 U251 异种移植物的生长延迟 148%[4]。在小鼠模型中，Temsirolimus 对 mTOR 的抑制提高了四种不同行为任务的表现并减少了聚集体形成亨廷顿病[5]。?给予替西罗莫司诱导显着的剂量依赖性抗肿瘤反应，对抗 8226、OPM-2 和 U266 异种移植物的皮下生长，ED₅₀ 为8226 和 OPM-2 分别为 20 mg/kg 和 2 mg/kg，它们与抑制增殖和血管生成、诱导细胞凋亡和缩小肿瘤细胞大小有关[6]。}

体外：Temsirolimus 有效抑制 mTOR 激酶活性，IC₅₀ 为 1.76 μM，类似于 rapamycin 在没有 FKBP12 的情况下 IC₅₀ 为 1.74 μM。 Temsirolimus（10 nM 至 <5 μM）通过 FKBP12 依赖性机制显示适度和选择性的抗增殖活性，但可以在低微摩尔浓度（5-15 μM）下完全抑制大量肿瘤细胞的增殖，涉及 FKBP12 非依赖性抑制 mTOR 信号。微摩尔而不是纳摩尔浓度 (20 μM) 的替西罗莫司处理导致整体蛋白质合成和多核糖体分解的显着下降，同时翻译延伸因子 eEF2 和翻译起始因子 eIF2A 的磷酸化迅速增加^{[1]< /sup>。替西罗莫司抑制核糖体蛋白 S6 的磷酸化，在 PTEN 阳性 DU145 细胞中比在 PTEN 阴性 PC-3 细胞中更有效，并以浓度依赖性方式抑制两种细胞的细胞生长和克隆形成存活[2]< /sup>。 Temsirolimus (100 ng/mL) 有效抑制原代人淋巴细胞白血病 (ALL) 细胞的增殖并诱导细胞凋亡[3]。}

体内：CCI-779（20 mg/kg，腹腔注射）抑制两种前列腺癌异种移植物的生长，PC-3 肿瘤的生长以剂量依赖性方式受到抑制，并且生长抑制作用大于 DU145 肿瘤^{[2 ]}。在具有人类 ALL 的 NOD/SCID 异种移植模型中，10 mg/kg/天的替西罗莫司治疗导致外周血母细胞减少和脾肿大^[3]。与对照组相比，Temsirolimus（20 mg/kg，ip 5 天/周）给药后 1 周后 DAOY 异种移植物的生长显着延迟 160%，2 周后延迟 240%。单次大剂量 Temsirolimus (100 mg/kg, ip) 治疗可在 1 周内诱导 37% 的肿瘤体积消退。替西罗莫司治疗 2 周还将耐雷帕霉素 U251 异种移植物的生长延迟了 148%^[4]。在亨廷顿病小鼠模型中，替西罗莫司对 mTOR 的抑制可提高四种不同行为任务的表现并减少聚集体形成^[5]。给药替西罗莫司可诱导显着的剂量依赖性抗肿瘤反应，对抗 8226、OPM-2 和 U266 异种移植物的皮下生长，8226 和 OPM-2 的 ED₅₀ 分别为 20 mg/kg 和 2 mg/kg , 它们分别与抑制增殖和血管生成、诱导细胞凋亡和缩小肿瘤细胞大小有关^[6]。

激酶试验：将带有 Flag 标签的野生型人类 mTOR (Flag-mTOR) DNA 构建体瞬时转染至 HEK293 细胞中。 48小时后进行Flag-mTOR的蛋白质提取和纯化。在 96 孔板中，在存在不同浓度的 Temsirolimus（不含 FKBP12）的情况下，对纯化的 Flag-mTOR 进行体外激酶测定，并使用 His6-S6K1 作为底物，通过解离增强镧系元素荧光免疫测定 (DELFIA) 进行检测。首先将酶在激酶测定缓冲液（10 mM Hepes (pH 7.4)、50 mM NaCl、50 mM β-甘油磷酸、10 mM MnCl2、0.5 mM DTT、0.25 μM 微囊藻毒素 LR 和 100 μg/mL BSA）中稀释。将 12 μL 稀释酶与 0.5 μL Temsirolimus 短暂混合到每个孔中。通过添加含有 ATP 和 His6-S6K 的 12.5 μL 激酶测定缓冲液来启动激酶反应，最终反应体积为 25 μL，其中含有 800 ng/mL FLAG-mTOR、100 μM ATP 和 1.25 μM His6-S6K。将反应板在室温下轻轻摇动孵育 2 小时（1-6 小时呈线性），然后添加 25 μL 终止缓冲液（20 mM Hepes (pH 7.4)、20 mM EDTA 和 20 mM EGTA）终止反应。使用铕-N1-ITC (Eu) 标记的单克隆抗 P(T389)-p70S6K 抗体（每个抗体 10.4 Eu）在室温下对磷酸化 (Thr-389) His6-S6K 进行 DELFIA 检测。将 45 μL 终止的激酶反应混合物转移至含有 55 μL PBS 的 MaxiSorp 板中。 His6-S6K 允许附着 2 小时，然后吸出孔并用 PBS 洗涤一次。添加 100 μL 含有 40 ng/mL Eu-P(T389)-S6K 抗体的 DELFIA 缓冲液。轻轻搅拌，抗体结合持续 1 小时。然后将孔吸出并用含有 0.05% Tween 20 (PBST) 的 PBS 洗涤四次。将 100 μL DELFIA 增强溶液添加到每个孔中，并在 PerkinElmer Victor 型读板器中读取板的读数。

细胞试验：各种治疗后前列腺癌细胞的存活率也通过集落形成测定来确定。将指数生长的细胞暴露于不同剂量的米托蒽醌或多西他赛 24 小时，或暴露于 CCI-779 3 天。处理后，洗涤细胞并用胰蛋白酶消化。将连续稀释液接种在 6 孔板中的 5 mL 培养基中。将板在 37°C、含 5% CO2、90% 湿度的气氛中孵育 10 天。然后用亚甲蓝对板进行染色，并对含有 > 50 个细胞的集落进行计数。

动物体内实验:为了生成异种移植物，将细胞植入基质胶中；基质胶储存于-20°C，然后在使用前在4°C的冰上解冻3小时。将细胞轻轻重悬于 1 mL PBS 中，并在冰上孵育 5 分钟。使用预冷的移液器将细胞转移至含有1 mL基质胶的管中，并将细胞浓度调节至3×107/mL。使用 25 号针将细胞（0.1 mL 中的 3×106 个）皮下注射到小鼠的两侧。当异种移植物长到直径约5毫米时，将动物随机分为10只小鼠的组。进行以下实验：用CCI-779（每天每公斤1、5、10和20毫克）或载体溶液治疗携带PC-3肿瘤的小鼠，每周3或5天，持续3周。携带 DU145 肿瘤的小鼠仅接受 CCI-779（每天每公斤 20 毫克）或载体溶液治疗 3 周。携带 PC-3 肿瘤的小鼠接受以下治疗：（a）对照，CCI-779 的载体溶液； (b)单独化疗，每周腹膜内注射米托蒽醌1.5mg/kg或多西紫杉醇10mg/kg，共3剂； (c)单独的CCI-779，每天腹膜内注射5或10mg/kg，每周3次，持续3周； (4)化疗后采用CCI-779。

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研究领域：PI3K/Akt/mTOR  |  Autophagy  |  Apoptosis  |  Anti-infection

作用靶点：mTOR  |  Autophagy  |  Apoptosis  |  Bacterial

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参考文献：

[1]. Shor B, et al. A new pharmacologic action of CCI-779 involves FKBP12-independent inhibition of mTOR kinase activity and profound repression of global protein synthesis. Cancer Res, 2008, 68(8), 2934-2943.[2]. Wu L, et al. Effects of the mammalian target of rapamycin inhibitor CCI-779 used alone or with chemotherapy on human prostate cancer cells and xenografts. Cancer Res, 2005, 65(7), 2825-2831.[3]. Teachey DT, et al. The mTOR inhibitor CCI-779 induces apoptosis and inhibits growth in preclinical models of primary adult human ALL. Blood, 2006, 107(3), 1149-1155.[4]. Geoerger B, et al. Antitumor activity of the rapamycin analog CCI-779 in human primitive neuroectodermal tumor/medulloblastoma models as single agent and in combination chemotherapy. Cancer Res, 2001, 61(4), 1527-1532.[5]. Ravikumar B, et al. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat Genet. 2004 Jun;36(6):585-95. Epub 2004 May 16.[6]. Frost P, et al. In vivo antitumor effects of the mTOR inhibitor CCI-779 against human multiple myeloma cells in a xenograft model. Blood. 2004 Dec 15;104(13):4181-7. Epub 2004 Aug 10.[7]. Dela Cruz FS, et al. A case study of an integrative genomic and experimental therapeutic approach for rare tumors: identification of vulnerabilities in a pediatric poorly differentiated carcinoma. Genome Med. 2016 Oct 31;8(1):116.[8]. Jason C. Choi, et al. Temsirolimus activates autophagy and ameliorates cardiomyopathy caused by lamin A/C gene mutation. Sci Transl Med. 2012 Jul 25; 4(144): 144ra102.