人激活素A(ACVA)化学发光免疫检测试剂盒

试剂盒组成：

特别说明：

*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.

相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心CLIA法。用抗人ACVA抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人ACVA会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人ACVA抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人ACVA抗体与结合在包被抗体上的人ACVA结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入发光底物混合液，发光底物在辣根过氧化物酶的催化下发出荧光，用化学发光免疫分析仪测定化学发光值（CL），人ACVA浓度与化学发光值之间呈正相关，通过绘制标准曲线计算出样品中人ACVA的浓度。

样品收集:

1.       血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.       血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.       组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.       细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.       其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测

具体处理方法可参考：http://www.elabscience.cn/index.php/resources/view/aid/17671.jsp

6.       样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.       样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。

8.       如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。

试验所需自备物品:

1.       化学发光免疫分析仪

2.       高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.       37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.       吸水纸

检测前准备工作:

1.         请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.         将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

3.         标准品: 加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，静置10分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀（浓度为5000pg/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、0ng/mL，标准品&样品稀释液直接作为空白孔0pg/mL。如配制2500pg/mL标准品：取0.5mL5000pg/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。

4.         生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

5.        酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。当日使用。

6.        发光底物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，将发光底物A液和B液等体积混合。当日使用。

洗涤方法:

1.         自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。

2.         手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.     加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.     弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.     弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.     每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

5.     弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.     每孔加混合好的发光底物工作液100μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育5分钟。

7.     立即用化学发光免疫分析仪测定各孔的化学发光值。应提前打开化学发光免疫分析仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

8.     实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

注意事项：

1.       保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。

2.       酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按推荐温度存放！

3.       加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间最好控制在10分钟内。推荐设置复孔。

4.       温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。

5.       洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

6.       试剂配制：Concentrated BiotinylatedDetection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用前1000转/分离心1min，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated BiotinylatedDetection Ab时，一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。

7.       底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

8.       混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

9.       安全：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。

10.   不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液除外）

11.   试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！