Northern Blot原理及实验方法

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。实验方法：

[仪器、试剂、材料]
（一）仪器
恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。
（二）材料
总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜
（三）试剂
NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]
1. 用具的准备：
180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：
1．称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)
2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子
如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）
5．检查点样孔。

4. RNA样品的制备
在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5. 电泳：
1. 将RNA样品小心加到点样孔中。
2. 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。
3. 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。
注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6. 转膜
1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。
2．用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。
3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。
8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
12．将膜在-20℃保存。

7. 探针的制备
1．在1.5ml离心管中配制以下反应液：
模板DNA(25 ng) 　　　　1ul
Random Primer 2ul
灭菌水11ul
总体积：14ul
2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。
3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
5．65°C加热5min使酶失活。
　　　
8. 探针的纯化及比活性测定：
1．准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。
2．取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处
4．100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。
5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。
6．将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。
7．1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.
8．测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。　

9．预杂交：
1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。

10．探针变性：
1．用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
2．90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。
3．短暂离心，将溶液收集到管底。

11．杂交：
1．加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
2．42℃杂交过夜（14~24hr）。
杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。

12．洗膜：
1．低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。
2．高严紧性洗膜：加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃摇动洗膜20min两次。

13．曝光：
1．将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
2．检查膜上放射性强度，估计曝光时间
3．将X光底片覆盖与膜上，曝光
4．冲洗X光底片，扫描记录结果。

14．去除膜上的探针：将200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15．杂交结果

注意事项：
操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡

实验完成时间：

1个月以内

【本平台合作项目】

分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！

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  公司简介

重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司（简称“威斯腾生物”）是重庆高圣医药有限责任公司参与组建，放眼于全球生物医药前沿技术转化应用开发，立足于全国生物医药研发检测合作及项目孵化、成果转化，现在发展为一家集生物医药技术转化、分子诊断产品开发及创新生物药物开发的科技集团公司。威斯腾生物致力于重大疾病包括恶性肿瘤、重大传染病等领域的早期筛查及快速检测。公司总部设立于重庆高新区，同时在上海和北京设有管理团队和运行机构。 
威斯腾生物拥有专家顾问团队千人专家7人，长江学者2人，海外院士2人；现有固定研发人员100余人同时还拥有320人的海外科研顾问团队。拥有完善的基础实验平台、先进的实验设备、专业的技术团队、标准的操作流程、优质的合作平台和强大的科学家网络，可为国内外研发机构与药企提供专业的生物研发检测合作和科技成果转化项目指导。七大基础服务平台包括：细胞生物学研究平台、分子生物学研究平台、病理学研究平台、免疫学研究平台、动物模型研究平台、蛋白质与多肽研究平台、测序和芯片研究平台。此外，公司拥有四大创新研发中心：分子诊断开发平台,CRISPR/Cas9靶向基因修饰药物开发平台、纳米靶向载药创新平台、创新药物筛选平台，除了进行公司的研发项目外，还可为从事相关研究的团队和企业提供个性化服务。
威斯腾生物研发中心一直致力于高端分子诊断产品的创新研发，拥有国内外处于领先地位的核心技术包括超微量核酸快速提取技术、快速荧光原位杂交（FISH）技术，CRISPR/Cas9基因定点编辑技术，荧光量子点材料开发和运用，医学模式动物开发等。
重点研发领域包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤的快速早期诊断，目前已成功开发非小细胞肺癌快速FISH诊断试剂盒、乳腺癌快速FISH诊断试剂盒、超微量粪便核酸快速诊断结直肠癌试剂盒等产品，其中非小细胞肺癌快速FISH诊断试剂盒入选重庆市技术创新与应用示范专项（产业类）重点研发项目名单，获中国生物医药创新创业项目最具投资价值TOP10评选赛北京站荣获一等奖、第八届中国创新创业大赛生物医药行业组重庆赛区冠军等。
同时，公司在重大传染病的快速检测及诊断上进行了研发布局，包括结核、EV71手足口病等重大传染病的快速诊断，拥有项目包括超微量尿液核酸检测结核试剂盒、量子点荧光标记传染病快速检测试剂盒等。新冠病毒疫情爆发后，威斯腾生物第一时间组建“新型冠状病毒试剂盒紧急研究小组”及“新型冠状病毒研发物资采购小组”，自筹经费成功研发新型冠状病毒（2019-nCoV）快速核酸检测试剂盒（免核酸提取荧光PCR一步法）、新冠病毒粪便RNA核酸提取试剂盒。产品已提供给20家以上的疾控中心和公共卫生中心使用，并与以上第三方疾控中心/公共卫生中心建立起了长期稳定的试用关系。
威斯腾生物是国家高新技术企业、科技型企业、市级新型研发机构、专精特新企业、北京市海淀区生物医药与大健康协会副会长单位、重庆市医药行业协会副会长单位。下属研发平台被认定为“中关村生物医药共享平台”、“中关村海淀区生物医药公共研发检测平台”、“重庆市生物医药检测共享平台”等。公司多次在全国性比赛中获奖，2019年荣荣获第八届中国创新创业大赛生物医药行业组重庆赛区冠军。
同时，威斯腾生物积极参与国际技术转移、成果转化相关合作，与美国、澳大利亚、新加坡等相关高校、研究院所建立了深厚的联系和多元化的合作，公司坚持以“技术创新、机制创新，文化创新，管理创新，战略创新”的理念，为重大恶性肿瘤、传染病疾病等领域的创新研发而不懈努力。
 

  核心竞争力

• 荧光量子点材料开发和运用
• 快速荧光原位杂交（FISH）
• CRISPR/Cas9基因定点编辑技术
• 基因芯片诊断
• ChIP表观遗传研究
• 医学模式动物开发

产业布局：

• 科技服务
• ctDNA,CTC液体活检
• 病理医学诊断
• PDX肿瘤筛查
• POCT产品开发
• IVD产品开发
• 分子医学诊断
• 创新研发系统

  行业交流

  2015年12月 由中国医药企业发展促进会、中国医药科技成果转化中心主办，重庆市医药 产业发展办公室指导，威斯腾生物医药承办的“首届2015·中国（重庆）生物医药前沿技术与产业化发展研讨会”在重庆渝州宾馆隆重举行；

  2016年4月  新加坡工程院院士、美国电子工程院连勇院士到威斯腾生物医药交流访问；

  2016年6月  美中药协（SAPA）总会前会长、美国强生公司研发总监、美国药学家协会院士戴卫国博士到威斯腾生物医药交流访问；

  2016年6月  威斯腾生物医药受邀参加第二届药学进展前沿高峰论坛；

  2016年8月  威斯腾生物医药受邀参加2016北京生物医药科技成果展示暨项目推介会；

  2016年10月  威斯腾生物医药受邀参加“科技部科技成果直通车暨首届科技成果路演活动”；

  2016年10月  威斯腾生物医药受邀参加2016中国（泰州）抗体药物高峰论坛；

  2016年11月  威斯腾生物医药受邀参加中国医药企业发展促进会第三次会员代表大会；

  2016年11月  威斯腾生物医药成为诺奖医学峰会投资委员会常务委员单位；

  2016年12月  威斯腾生物医药受邀参加北京市海淀区生物与健康产业协会第一届会员大会暨2016中关村核心区生物与健康产业发展高峰论坛；

  2017年1月   威斯腾生物医药受邀参加首届国际未来论坛；

  2017年1月   威斯腾生物医药受邀参加第二届中国天使两会双创年度盛典；

  2017年3月  北京生物技术和新医药产业促进中心潘悦主任一行到威斯腾生物医药交流访 问；

  2017年4月   威斯腾生物医药受邀参加四川省人民政府主办的医药健康产业深度合作和创新发展座谈会。

  企业文化

  公开透明的竞争文化机制

  竞争文化的培养是企业文化着重培养的重要内容，良好的竞争氛围使每位员工不甘落后和停滞。采取正确的竞争策略，能够极大地调动企业员工的积极性、创造性，焕发出竞争精神和创新精神，使人的潜能得到全面、充分地发挥，从而使整个企业的竞争能力得到全面地提高。

  公开透明的竞争机制的建立，使每位员工看到并享有畅通的晋升通道，保证每位员工在威斯腾都能一展所长。

  重视素质培养和全面发展

  威斯腾非常注重企业文化的建设，提倡“以人为本”的人才理念，关注员工的持续成长，倡导正能量，形成“勤奋，忠诚，热情，向上”的企业文化。

  素质是人的品质、能力、素养的总称，企业员工的职业素质是影响企业管理与发展的重要因素。高素质的人才，不在于经验的长久，而在于长久的经验培育出来的能力。提升员工素质是揭示各个方面及竞争力的利器。员工个人不仅可以参加企业组织的各种培训，还主动积极的进行自我学习与提高，不断的修炼自我，提高自身的职业素质，从而达到与时俱进，增强竞争力。

  和谐“家”文化

  公司提倡和谐“家”文化，致力于为员工提供良好的办公环境、营造轻松舒适的办公氛围，公司在对员工关怀上下足了工夫，让每一位企业员工真正感受企业文化的力量。”威斯腾管理委员会委员如是表示。一个好的公司，不能仅仅只注重品牌的打造，更要重视人才、重视技术、重视企业文化建设。这就是一个富有朝气，活力的威斯腾生物！