XXXX原代细胞干预培养与激光共聚焦蛋白细胞定位实验

实验试剂：PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)（实验室常规配置）；非免疫山羊血清；Triton X-100（sigma）；BSA抗体稀释液（实验室常规配置）；A蛋白抗体（Santa cruz）；B蛋白抗体（Abcam）；Alexa Fluor® 488 donkey anti-goat IgG (H+L)(Invitrogen)；Alexa Fluor® 555 Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment(Invitrogen)
上述试剂均由嘉美生物代买。

实验仪器：激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCS-SP5型)

实验步骤：将细胞每孔2ml（密度为2*106/L）传至激光共聚焦专用培养皿；接种24h后，采用刺激物处理；25min后培养皿内细胞培养液，PBS冲洗3次，2-4%甲醛固定15min；1×PBS缓冲液（0.01M，pH7.4）洗涤3次，每次5min，滴加非免疫山羊血清（内含0.3%Triton X-100）封闭液,覆盖液面2-3mm，室温放置60min，除去多余液体；加A蛋白一抗50μL（1:100），4℃下过夜；PBS洗3次，每次5min，加荧光标记的A蛋白二抗 [Alexa Fluor® 488 donkey anti-goat IgG (H+L)] 50μL（1:200），室温下放置60min；PBS冲洗3次，加B蛋白一抗50μL（1:500）37℃下放置1h，PBS洗3次，每次5min；加荧光标记的B蛋白二抗[(Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment)] 50μL（1:200），置于室温下60 min；PBS洗3次，每次5min；激光共聚焦显微镜下观察、拍照，每组照相2张，用MOTIC FLUO1.0生物荧光分析处理软件将图片进行量化。
实验分组：刺激物分4组。培养液中刺激物的终浓度：刺激物L0.5ng/ml；刺激物S20nM；刺激时间25分钟
1组：control（DMEM培养液）
2组：刺激物L
3组：刺激物S 
4组：刺激物L+S

实验结果：

1组：control（DMEM培养液）

2组：刺激物L

3组：刺激物S

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4组：刺激物L+S

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