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高内涵筛选的优势

为了快速的寻找药物靶标或功能基因，高通量筛选成为研究的重要工具。高通量筛选模型主要建立在分子水平之上，针对单一药物靶点对被筛样品的活性进行评价，仅能够得到有限的活性数据，无法全面反映出被筛样品的生物活性特征，因此初筛得到的阳性结果仍需要进一步确认。
高内涵筛选选则能够在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导等方面的影响，在单一实验中获取大量与基因、蛋白质及其他细胞成分相关的信息，确定被筛样品生物活性和潜在毒性的过程。高内涵筛选应用高分辨率的荧光数码影像系统获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息，对其多角度分析。

 

高内涵筛选系统的组成

1．荧光显微系统

　　许多化合物只能引起细胞形态、细胞器形态和分子分布等微弱的改变，因此必须使用高分辨率的荧光显微系统才能够检测出来。细胞与荧光标记物结合后，其生理状态的改变即可被荧光显微系统的荧光探针捕获。

2．自动化荧光图像获取系统

　　在观察到荧光标记的细胞变化后，可用高分辨率CCD相机将图像拍摄下来。自动化荧光图像获取系统可快速并精确地移动细胞培养板或载玻片，自由转换各种波长的激光及散射滤光片以满足多种研究需要。若同步使用激光共聚焦技术则可以与多种细胞培养板匹配，在较短时间内完成96孔板或384孔板样品分析。另外，还可添加温度控制系统以维持细胞活性，以及添加自动加样系统和白光系统等。

3．检测仪器

　　观察并获取图像只是高内涵筛选技术的第一步，为了有效完成分析工作，必须利用检测仪器从图像中提取有价值的信息。目前，一些公司开发了应用变化终点检测和动态活细胞检测相结合分析方法的检测仪器以拓展检测范围。代表性的是美国Cellomics公司开发出的ArrayScan HCS Reader和KineticScanTMHCS Reader等。

4．图像处理分析软件

　　随着高内涵筛选系统的升级，需要一种新型的高内涵筛选软件简化和自动化其操作,从而更加准确地测定基于形态学和荧光标记的细胞特征参数。例如Cellomics公司开发的BioApplication软件可将多种来源的图像数据转化为生物学信息，包括来自荧光检测、激光共聚焦、扫描流式细胞检测及其他高内涵筛选检测仪器的图像数据。

5．结果分析和数据管理系统

　　上述应用软件可用于追踪分析多种细胞变化过程，如信号分子转位、受体内源化、钙离子化、酶活化、细胞凋亡、细胞周期以及神经突触生长等，通过分析个体和群体细胞水平的多种特征获取有意义的生物信息。数据管理系统用来储存和管理已获取的图像和定量分析结果，并能够将这些结果以图像、表格等多种形式在个体和群体细胞水平输出，使研究人员能够系统地进行总结并作出决策。 
 

高内涵筛选的应用实例

1．细胞运动性检测

细胞的运动特性影响细胞的很多生理和病理学过程，如癌细胞转移、炎症、血管形成、创伤修复和胚胎发育等。高内涵筛选能够通过测定迁移细胞的运动轨迹分析细胞的运动能力。实验在铺满标记荧光珠子的毯状结构上进行，随着细胞移动，珠子不断被吞噬而记录下其运动轨迹，轨迹面积与细胞运动能力大小是成比例的。
吉凯实验实例： 
针对不同基因的靶点病毒和对照病毒（877）分别感染细胞，四天后将准备好的细胞种植于事先铺满单层fluorescent beads的特殊处理过的96孔板上，培养24h后，进行固定、染色，对单个细胞标记后，用cellomics进行高通量扫描，通过统计Full-Track-Area、Motion-Track-Area、FullTrackAreaPerCell 、MotionTrackAreaPerCell等参数进行统计筛选。分析细胞运动能力的改变。
  

 

2．细胞周期检测

PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 结合后能被激发产生荧光,通过cellomics arrayscan检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度可以反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ,G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过cellomics arrayscan拍照，利用图像分析软件可以将细胞周期各时相区分为G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通过软件计算各时相的百分率。
吉凯应用实例： 
分别将阴性对照靶点和多个目的基因有效靶点慢病毒感染肿瘤细胞，通过cellomics仪器对细胞进行扫描分析，得到的周期实验结果如下：
  
 

3．细胞增殖检测

利用转染、感染、染色等方法将荧光标志物（如GFP、Hochest等）对细胞进行荧光标记，利用Cellomics仪器冷阴极放电(CCD) 镜头对细胞拍照得到高分辨的图像,获得带荧光的细胞多方位信息，通过软件分析处理计算出孔板中不同组别含有的细胞数目。基于cellomics仪器的细胞计数实验具高效、准确、快速等特点。
吉凯实验实例： 
将针对不同基因的RNA干扰靶点的慢病毒（同时表达GFP）感染的各组细胞接种到96孔板中放入培养箱中培养。每天将培养的细胞在cellomics仪器上扫描拍照，应用vHCS Scan扫描软件并调取检测细胞计数的实验程序对孔板进行扫描计数，连续检测5天，每天在相同时间检测一次，得到5个结果，最后对这5天数据进行软件分析，得到细胞个数等信息，并进行结果分析，从而得到该细胞增殖图。
   
 

4、血管生成能力检测

Matrigel tube formation实验是经典的研究肿瘤细胞分泌因子对血管内皮细胞（HUVEC）成血管能力的影响的实验，通过cellomics拍照及图像处理系统，可以一次性的得到血管密度，血管长度，血管节点数目等众多来反映成血管能力的强弱的数据指标。
吉凯实验示例： 
在96孔板上均匀铺入Matrigel，37度培养箱培养使其凝固，将HUVEC细胞用5%的FBS重悬；与不同基因敲减后，肿瘤细胞A549分泌上混合培养24h，染色后用cellomics进行高通量扫描，通过对tube counts & density、tube location、tube area、tube length & width等分析，判断促进血管生成能力的差异。
  

 

5、肿瘤细胞克隆形成能力检测

克隆形成实验是测定细胞增殖能力和独立生存能力重要方法。通过细胞在培养板上的克隆形成能力来反映细胞的成瘤能力。通过cellomics array scan对形成的细胞群落进行扫描后，获得的数据可以分析细胞形成克隆的能力。
吉凯实验实例 
分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞，三天后将处于对数生长期的细胞消化，在96孔板培养板中接种200个细胞/孔，继续培养到对照组单个克隆中细胞数大于5天为止。用cellomics array scan仪器对孔扫描拍照，统计分析形成的克隆数目、克隆大小以及克隆内的细胞数。