▨组织块培养法

1. 组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2. 加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

3. 当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。

4. 为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

▨ 贴壁型原代细胞

1. 原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2. 适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3. 尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

▨悬浮型原代细胞

1. 必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2. 能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。


原代细胞培养问题

▨ 原代细胞与细胞系有什么区别？

1.根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞。这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。
细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。
但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。
需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。 

2. 能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

 

▨ 倍增和代数有什么区别？

倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。 
 

▨ 接收到的冻存细胞该如何处理？

收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快，以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。 
 

▨ 冻存的细胞该如何开始培养？

1. 将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。

2. 将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。

3. 将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。

4. 用70％的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。

5. 打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹（注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象）。

6. 用多聚赖氨酸（或参照说明书）包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。

7. 盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。

8. 将培养瓶放入培养箱中（37℃，5%CO2，95%空气）

9. 放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未贴壁的细胞。 
 

▨ 细胞培养过程中，多久更换一次培养基？

这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。

注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和死亡的细胞。
 

▨我能扩增培养和再次冻存原代正常人类细胞吗？

这取决于细胞的类型。

一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。

其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。

然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。
 

▨ 培养瓶中应该加入多少体积的培养基？

我们推荐的用量为：

Nest T-25培养瓶5mL

T-75培养瓶15mL

T-225培养瓶50mL

国内领先的生命科学领域耗材制造商
无锡耐思生命科技股份有限公司（以下简称“耐思”）于 2009 年成立，并创立 NEST 品牌，秉持“做高端耗材，创国际知名品牌”的信念，专注于生命科学领域产品的研发与制造。耐思拥有 7500m² 十万级洁净车间，2500m² 万级洁净车间，成熟的生产工艺、先进的机器设备、专业的研发中心、资深的管理团队，是国内领先的医疗器械和生命科学领域耗材制造商。
2020 年，公司正式更名为无锡耐思生命科技股份有限公司。
 
美国分公司成立
随着业务的发展，NEST 产品已远销北美、欧洲、日本、韩国、印度等全球多个国家，为了与海外客户建立深厚的合作关系，并更快地将产品送到海外客户手中， 我们于2003年在美国新泽西州成了了NEST美国分公司。NEST美国是属于无锡耐思生命科技股份有限公司的分支机构，拥有一支具有丰富经验和销售技巧的专业团队，能与客户进行深入的沟通，更好更快地了解客户需求，并给予专业的技术支持。2022年，NEST美国将在亚利桑那州凤凰城开设一个新的48,000英尺的仓库，随着新仓库的落成，将为客户极大的降低了存储与物流成本。
 
引进先进设备，确保品质稳定
耐思为确保质量的稳定，实现“原料采购 - 生产 - 包装 - 灭菌 - 交付”的无缝对接， 2012年投资1.5亿新建了2.7万平米厂房（无尘洁净车间），且引进国际先进电子辐照设备RhodotronTT200（辐照灭菌流程经 ISO13485、ISO11137 质量体系认证），进口符合USP CLASS 6的医用级原材料，按GMP质量管理规范标准化生产，现已取得ISO 9001、ISO 13485、ISO 11137、FDA、CE 认证及医疗器械生产许可证。
2021年NEST新增4500m²十万级洁净车间和1500m²万级洁净车间，用于医疗器械与医药包装耗材的生产。
 
三大类产品——实验室耗材、医疗器械、医药包装耗材
耐思的产品分为三大类：实验室耗材（细胞学类耗材、微生物检测类耗材、分子生物学类耗材、通用耗材类）、医疗器械和医药包装耗材。产品适用于医药、农业、轻化工、食品、环保、生物能源、海洋生物资源、再生医学等生命科学领域，品项多、规格全，满足了客户不同的需求。相比进口耗材，NEST 货期短、品质优、价格低，可大大提高工作效率并降低使用成本。
 
定制服务
无锡耐思生命科技股份有限公司拥有强大的模具设计能力及机床精密加工及塑料成型能力，除常规品的销售，同时向行业提供各种定制服务。
 
发展历程
2009年，成立：创立NEST品牌，从细胞培养类产品开始研发
2010年，市场开拓：参加德国慕尼黑，美国PITTCON，正式开始进军海外市场
2011年，通过ISO 9001认证
2012年，筹建新工厂
2013年，美国耐思成立：新增分子生物学耗材，开始研发细胞工厂
2014年，新车间投入生产，灭菌中心通过ISO 11137认证：投资1.5亿新建2.7万平米厂方，引进比利时RhodotronTT200电子束辐照设备灭菌中心通过ISO11137认证
2015年，灭菌中心正式投入使用
2016年，通过ISO 13485认证：细胞工厂验证完成，正式投放市场
2017年，完善工业类客户产品线：细胞工厂系列、摇瓶系列等产品上市
2018年，优化管理，升级设备，研发医疗器械类产品，为获取医疗器械生产许可证而做准备
2019年，取得医疗器械生产许可证，销量破亿
2020年，无锡耐思生命科技股份有限公司成立，开发新冠防疫物资
2021年，在美国新泽西州新增3300m²仓库和研发基地
2022年，在美国亚利桑那州新增4500m²的仓库，极大的降低了存储与物流成本
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