技术优势

1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异
2. 高深度测序，可发现变异频率低于1%的罕见变异
3. 仅针对外显子组区域，有效降低测序费用、存储空间和工作量

产品应用
相比于全基因组测序，外显子区域占比小（约1%），因此更容易做到更高深度测序，检测到更多低频和罕见变异，同时也能降低测序费用和存储空间。外显子测序，50M的捕获区域，测序数据量10-12Gb就可以得到100X的有效测序深度。这个特性决定了外显子测序在遗传性疾病和肿瘤研究中的重要作用，特别是做肿瘤异质性研究。由于肿瘤异质性，肿瘤内部有很多亚克隆，有些亚克隆的占比很低，应用外显子高深度测序可以更快、更经济地检测出普通测序深度难以发现的体细胞突变。

图1 外显子测序产品应用

         华大基因采用Agilent等液相捕获系统，对人的全外显子组区域的DNA进行高效捕获富集，然后提供基于DNBSEQTM测序技术的捕获测序服务。建库和杂交实验采用官方指定试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照经过优化的实验流程进行操作。如下为DNBSEQTM外显子测序技术流程。

图2 DNBSEQTM平台外显子建库流程

图3 DNBSEQTM平台优势

        首先，单链环状 DNA 分子通过滚环复制，线性扩增2-3个数量级，增强信号。所产生的扩增产物称为DNA纳米球（DNA nanoball, DNB），采用高密度DNA纳米芯片技术，将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内（固定在阵列化的硅芯片上）。通过联合探针锚定聚合技术（cPAS）和多重置换扩增的双末端测序法（MDA-PE）得到读长为100bp/150bp的双末端序列。

图4 DNA 纳米球示意图

       MDA-PE的具体原理是：完成第一链（Forward Strand）测序后，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，合成第二链（Reverse Strand），并通过DNA分子锚，进行第二链的测序。MDA-PE法具有合成快、准确度高等优点。与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：

•  DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度。
• 不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积。
• DNB与芯片上的网状小孔大小相同，每个小孔只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰。
• 阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到充分利用。

信息分析
信息分析从测序的下机数据（raw data）开始，原始下机数据过滤掉接头、低质量碱基、未测出的碱基（以 N 表示）后比对到参考基因组上，进行SNP检测和InDel或者CNV分析，然后通过数据库注释，对变异检测的结果通过基于变异有害性、样本情况和基因功能表型三种分析策略，筛选出于疾病相关的有害性位点或基因。另外, 为了保证高质量的测序数据，在整个分析流程中设置了严格的数据质控体系（QC）。

图6 肿瘤信息分析内容

产品优势

1. 捕获平台：Agilent v6芯片和IDT等多种探针选择
2. 测序平台：单链滚环复制，更少PCR扩增错误引入
3. 质量卓越：DNBSEQ的变异检测一致性高，对InDel检测灵敏度更高，更适合高深度的肿瘤研究
4. 项目经验：发表国内第一篇外显子测序文章，项目经验10年＋，平台稳定
5. 广泛合作：大学、医院、科研院所、制药公司合作超过6000次，样品总数16万+

参考文献

1. Ng SB1, Turner EH., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature.461(7261):272-6.

2. Choi M1,Scholl UI., et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.Proc Natl Acad Sci USA. 106(45):19096-101.