16S/18S/ITS 扩增子测序
16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”,其序列包含9个可变区(Variable region)和10个保守区(constant region)。可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度,可以了解环境样品中群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起到重要作用。
18S rDNA或ITS(Internal Transcribed Spacer)被广泛应用在真菌分类鉴定中。18S rDNA在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类;ITS属于中度保守区域,利用它可研究种及种以下的分类阶元。
研究内容
16S/18S/ITS扩增子测序即通过提取环境样品的DNA,选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的某一或某几个区,使用Illumina测序将目的区域正反向读通,通过检测目的区域的序列变异和丰度,对环境样本物种分类及,丰度,种群结构,系统进化,群落比较等方面信息进行分析的研究方法。
产品优势
策略多样:不同来源样本采用不同提取方法和建库测序策略,满足多种环境研究需求。
平台多样:MiSeq/HiSeq2500/PacBio等多种平台可供选择,可满足16S/18S/ITS不同高变区域或全长测序的需求。
经验丰富:已测序样品类型涉及粪便、土壤、水体、唾液、牙菌斑、体腔、胃液、白带、空气、血液、皮屑等。
分析自动化:自动化分析平台,可多次提交不同的信息分析方案,客户可以主导信息分析过程。
售前、售后服务:提供结题报告解读视频及其他个性化售前售后服务。
样本需求量低:华大基因16S产品推荐DNA样本量50ng以上;对于样本获取困难的样本,只要样本量高于0ng也有可能建库成功。
数据交付指标高:华大基因对16S产品承诺交付clean tags(用于后续OTU/物种分析的有效数据量),承诺100%满足合同数据量。常见的16S数据交付指标有raw reads、clean reads、raw tags,clean tags等,受数据质量和目标区域长度的影响,一般的数据利用率(clean reads/raw reads)和拼接率(clean tags/clean reads)会在50%~100%之间波动。
建库流程
16S/18S/ITS扩增子建库推荐融合引物建库方法,即提前合成融合了目标序列引物和上机接头、index等序列的引物,通过一步PCR扩增直接完成建库。主要步骤如下:
样品检测:使用Qubit对样品浓度进行精确定量,检测合格的样品进行文库构建。
PCR体系构建:取30ng DNA样品及融合引物配置PCR反应体系。
PCR扩增:设置PCR反应参数进行PCR扩增。
产物纯化:使用磁珠进行纯化,文库构建完成。
文库质量检测:文库检测使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库的片段范围及浓度。
上机测序:文库检测合格,上机测序
测序策略
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扩增区域 |
引物名称 |
引物对 |
细菌 |
V4 |
515F |
GTGCCAGCMGCCGCGGTAA |
806R |
GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
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V1-V3 |
8F |
AGAGTTTGATYMTGGCTCAG |
|
518R |
ATTACCGCGGCTGCTGG |
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V3-V4 |
338F |
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG |
|
806R |
GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
||
V4-V5 |
515F |
GTGCCAGCMGCCGCGG |
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909R |
CCGTCAATTCMTTTRAGT |
||
真菌 |
ITS1 |
its1 |
CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA |
its2 |
GCTGCGTTCTTCATCGATGC |
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ITS2 |
its3 |
GCATCGATGAAGAACGCAGC |
|
its4 |
TCCTCCGCTTATTGATATGC |
*注:只有两端完全测通的Reads (Tags)才能用于进一步的分析,目前短读长测序最长测序读长为PE300,片段范围在530以上的建议选择长读长测序来做。
信息分析内容
分析模块 |
信息分析条款 |
数据处理 |
数据过滤 |
Reads拼接 |
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OTU聚类及分析 |
OTU统计 |
OTU venn图分析 |
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Core-Pan OTU分析 |
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OTU PCA分析 |
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OTU NMDS分析 |
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物种累计曲线分析 |
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OTU PLS-DA分析 |
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OTU Rank 曲线 |
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物种分类 |
物种丰度柱状图(多方案展示) |
物种丰度热图(多方案) |
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物种系统发育进化分析 |
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GraPhlAn 物种组成图 |
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物种PCA分析(样本≥ 3) |
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菌群分型分析样本(肠道样本) |
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单个样品多样性分析(alpha多样性) |
Alpha多样性统计表(包括observed species指数(sobs)、chao1指数、ace指数、shannon指数和simpson指数) |
Alpha多样性稀释曲线(多方案) |
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Alpha多样性盒形图 |
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样品间多样性比较分析(beta多样性) |
Beta多样性热图(Bray-Curtis,weighted UniFrac,unweighted UniFrac) |
样品聚类树 |
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PCoA |
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UPGMA 聚类树与丰度组合图 |
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Beta多样性指数组间差异分析(分组≥2,每组样本数≥3) |
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物种差异分析(分组≥2,每组样本数≥3) |
LEfSe分析 |
Wilcox Test |
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Kruskal Test |
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相似性分析检验分析(Analysis of similarity,ANOSIM) |
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PERMANOVA/Adonis分析(如关注物种与表型的关联需提供表型信息,否则默认分析物种与分组关联) |
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关键物种差异比较柱状图 |
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功能分析 |
KEGG功能预测 |
KEGG对应酶的编号及通路图 |
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COG 功能预测 |
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功能差异分析(Wilcox Test、STAMP) |
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关联分析与模型预测(个性化分析) |
CCA/RDA分析(需提供详细的环境因子数据) |
Spearman相关系数分析(需提供表型信息) |
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物种间相关系数网络图分析 |
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随机森林--ROC曲线(分组=2,每组样本数≥30) |
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SourceTracker (需要提供样本来源信息) |
单位名称: |
详细地址:
深圳市盐田区北山工业区华大综合园7栋
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qq:
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联系电话: |
Email: |