1）根据实验目的选择合适的载体

可根据载体抗性、启动子类型、可溶和表达荧光蛋白（GFP/RFP等）、是否需要筛选稳转株等选择合适的载体。

2）构建/选择高效的慢病毒载体

理论上慢病毒系统对外源片段容量能到8 kb，扣除启动子，筛选抗性基因等，应该还能容纳4 kb。但实际上2 kb以上的外源基因包装病毒产量就比2 kb以下的少很多。在做正式实验之前，可先进行小量包装，成功后再进行病毒大量包装。对于knockdown，通常是对一个基因同时选择3个（或以上）干扰靶点，通过qPCR验证干扰效率之后，选择效率最好的靶点进行下一步实验。

1） 取状态良好，处于对数生长期的293T细胞进行慢病毒包装。

2） 细胞铺板：再转染前24 h进行细胞铺板（根据实验需求选择合适的培养皿），转染时细胞密度控制在80%左右。（注意：铺细胞时可左右轻轻摇晃培养皿，以使细胞均有分布在培养皿中。）

3） 转染：取高质量质粒（包括慢病毒包装质粒和慢病毒载体）进行转染。转染完毕放入培养箱中（从生物安全考虑，应将慢病毒包装用的培养箱和普通细胞培养箱分开，培养条件一致）。

由于细胞已开始包装病毒颗粒, 之后的所有操作必需在生物安全柜内小心完成！

4） 换液：转染6~8 h后，将培养皿中的培养液移弃，加入新鲜的适量的培养液。

5） 收集慢病毒颗粒上清：根据实验需要，可收集转染后48 h/72 h的慢病毒颗粒上清。

6） 浓缩：若需要进一步提高慢病毒的滴度，可将收集好的慢病毒颗粒上清进行超速离心（50000 g， 2 h，4℃）。小心移去上清，用少量PBS或培养基溶解慢病毒颗粒（4℃，>2 h）。（注意：超速离心前可先低速离心以去除细胞碎片：3000 g，5 min）。

7） 保存：若直接保存慢病毒颗粒上清，低速离心后便可保存；若保存浓缩后的慢病毒颗粒，高速离心后直接保存即可。4℃可保存一周左右，长时间保存需要放置于-80℃。反复冻融会影响慢病毒的感染效率，建议进行分装保存。

1） 转染前18-24小时进行铺板，转染时细胞密度控制在80%左右。

2） 第二天加入适量病毒悬液。37℃孵育。

3） 继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

4） 继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达。在转染3-4天后开始加药筛选。