众所周知，单克隆抗体药物和CAR-T/CAR-NK治疗已经成为生物医药研发领域的新宠，然而，伴随而来的即是全球医药研发企业之间激烈的竞争。据国际抗体协会的数据统计截止到今年2月份，美国的在研单抗药物数量达到了760多个，其中上市的有94个单抗药物，并且有17个单抗药物处在审批阶段。中国在研单抗药物数量超过350个，其中国内上市的有28个，而根据国家药品监督管理局的数据统计，目前国产单抗药物只有13种。可见国际单抗药物的研发竞争态势异常激烈，加快单抗药物研发进程对于我国在该领域建立战略性优势具有重大意义。
| 单抗药物研发现状
在药物研发进程中，药物的脱靶效应如果未在研发早期发现并解决，不仅会影响药物的长期市场推广，对药物的临床施用也会带来巨大隐患。David Cook等专家对AstraZeneca公司在2005-2010年期间在研的142种小分子药物进行了追踪研究，发现62%的药物由于脱靶被暂停研发3。作为靶向药物的代表，无论单抗药物还是CAR-T/CAR-NT中CAR的设计，均是强调靶点唯一性和针对性的，一旦发生脱靶，不仅会降低疗效，还会带来未知的副作用隐患。美国Integral Molecular公司通过膜蛋白质组芯片技术（Membrane Proteome Array，MPA），对美国市场上在研的一大批单抗药物做了靶点特异性鉴定，发现23%的抗体都具有靶点多特异性（图1），说明抗体药物非特异性已经不是个例。
图1 在研药物脱靶情况分析
在Integral Molecular公司鉴定的这些抗体中，既有在临床II期实验比较顺利，并被大型药企高额收购的单抗；也有因为致死性副作用被叫停退出临床研究的单抗。通过MPA膜蛋白芯片技术的检测，均发现了这些抗体的多特异性问题（图2）。如果有好的技术手段能够在研究阶段就确定单抗药物是否具有多特异性的问题，那么无论对于药物研发团队还是对于收购药物的公司来说，都将避免巨大的资源浪费和公司市值的动荡。同时，对于病人来说，也减少了面对“生与死”的风险。
图2 单抗药物脱靶鉴定经典案例
| 单抗药物特异性鉴定策略
单抗药物等大分子药物主要针对细胞膜蛋白，如PD-L1、PD-1和 CTLA-4等免疫检查点设计，传统的检测手段，如免疫组化、流式等技术，要么分辨率不够，要么通量太小。普通的蛋白纯化技术很难表达纯化，并维持正确构象。Integral Molecular公司现任CEO Ben Doranz博士等6名资深专家创造性地开发了将5300余种膜蛋白（涵盖了人类94%的膜蛋白，包含所有的蛋白质类别，例如单次跨膜、多次跨膜和GPI锚定蛋白）表达于384孔板培养的活细胞表面的技术，即膜蛋白质组芯片（Membrane Proteome Array，MPA）技术。而将膜蛋白表达于细胞膜的表面，由于拥有磷脂双分子层的立体支撑，膜蛋白就能够保持正确的空间构象（图3），进而能够完成一系列基于膜蛋白的科学研究。而这些膜蛋白正是大分子抗体药物的主要作用靶点，或毒副作用的靶点。
图3 MPA膜蛋白质组芯片示意图
由于MPA膜蛋白质组芯片技术完美解决了膜蛋白筛选和鉴定的诸多难题，一经推出，便在抗体研究领域引发了强烈反响，迅速成为单抗药物靶点特异性鉴定的金标准技术，受到国内外IND评审专家的一致推荐。截止目前，Integral Molecular公司先后已经为超过400家医药企业和科研院所，推进过2000+单抗药物研究项目。在Nature、Cell、Science等顶级期刊发表的文献已经超过250篇（图4）。
图3 MPA膜蛋白质组芯片应用现状
| 单抗药物特异性鉴定策略
MPA的实验过程是将总量不超过500ug的抗体药物逐孔加入384孔板中，通过流式细胞仪技术鉴定抗体药物是否与细胞膜上的膜蛋白产生结合，并对阳性结果通过量化滴定实验进行验证，以确保实验结果的准确性。MPA膜蛋白质组芯片实验流程非常严谨，需分三个阶段逐步开展：
第一阶段，客户需提供单抗药物的目标靶点，实验平台会根据经验将抗体分为4个浓度与表达有膜蛋白的细胞进行孵育，利用高通量免疫荧光流式检测抗体与目标蛋白的结合情况，以筛选第二阶段正式实验最佳上样浓度，并确定阴性对照的假阳性率。第二阶段，将抗体采用第一阶段选定的最佳浓度与384孔板中的细胞进行孵育，利用高通量免疫荧光流式检测抗体与哪些孔中的细胞产生结合信号，通过独特的交叉孔排列组合验证的方式进行假阳性结合信号的排除，获取阳性结合蛋白列表。第三阶段，对细胞膜蛋白芯片筛选出的结合蛋白，采用一对一验证的方式再次确认阳性结合。验证通过标准：被验证的靶点与抗体结合能够呈现浓度梯度关系，并且最高的两个浓度的MFI荧光值 至少超过背景的 2 倍以上。以上严密的实验设计结合丰富的实验对照，既达到了获得高检测灵敏度的要求，又排除了假阳性结果的干扰。
| 服务资质
华盈生物作为 Integral Molecular 公司 MPA膜蛋白组芯片技术在中国大陆认证服务商，长期致力推广该技术在新兴免疫治疗药物研发阶段的广泛应用。截止目前，华盈生物已经为多家中国大陆单抗药物研发企业研发产品通过IND申报提供了关键质控数据。相信随着MPA细胞膜蛋白组芯片技术的帮助，国内大分子药物研发机构的IND申报速度将会得到质的提升，进一步提高在全球医药研发领域的竞争力。
| 相关文献
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