甲基化特异性PCR(MSP)检测基因启动子甲基化

甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。

CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。

因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如甲基化检测与低剂量CT相结合）、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。

MSP实验流程：

  抽提基因组DNA，并定量

 （组织、细胞、全血、血浆/清等）

亚硫酸氢钠处理DNA

（pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制）

DNA修饰后纯化回收

PCR/Real-time PCR检测（引物、退火温度）

琼脂糖凝胶电泳/拷贝数                                

难点：

1、 实验流程长，操作烦琐，不易控制；

2、 起始DNA量不能太多，否则修饰不完全；但量太少，在漫长的修饰、回收过程中容易丢失，所以要求熟练而精细的实验操作。

3、 修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反映时间。

4、 PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。

总之，在MSP过程中，影响结果的因素比较多，想要得比较好的实验结果，不仅要求高质量的实验试剂，更要求丰富的实验经验和良好的实验习惯。

迪奥生物凭借多年分子生物学实验经验和稳定的技术平台，还有数百例MSP的成功经验，已经建立了Taqman探针法检测基因启动子甲基化的技术体系，并且在临床应用方面与多家医院建立了稳定的合作关系！

使用仪器：美国应用生物系统公司（ABI）Veriti^TM梯度PCR仪

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