DNA甲基化检测服务

 甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。

CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。

因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测、个性化治疗等方面具有很高的应用价值。

该方法是检测甲基化的经典方法，也是最早采用的基因甲基化检测方法。方法是：通过两对引物，分别对应甲基化序列和非甲基化序列，对重亚硫酸盐转化后的DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析某个基因的甲基化情况。

  二. BSP（即亚硫酸盐测序）：定量方法

该方法是通过PCR产物克隆测序，然后用甲基化分析软件对测序序列与靶序列进行比对分析，可以得到如下数据：

1)  测序序列与靶序列的相似度；    2）转化效率；

3) 靶序列中每个位点的甲基化情况（点状图）； 4）靶序列中每个位点的甲基化频率（）

三. 高通量BSP检测
 
    该方法将传统的BSP与高通量测序（NGS）结合，既扩展了检测片段长度，又提高了检测准确性，实验成本也较BSP有大幅度的降低。
实验流程如下：
1. 实验设计：选择检测区域（Promoter/DMR）
2. 引物设计及合成：根据选定的区域设计BSP引物（可分段设计）
3. DNA亚硫酸盐转化：
4. PCR扩增：用BSP引物将要检测的片段扩增出来（可多重PCR）
5. PCR产物纯化：
6. PCR产物建库：将纯化后的PCR产物构建DNA文库
7. NGS测序：Illumina HiSeq, PE150；测序深度：>100X
8. 数据分析：单样本甲基化谱，多样本整合分析（统计分析），与基因表达数 据联合分析。 

四. 焦磷酸测序法(Pyrosequencing):  定量检测单个或相邻的几个CG位点的甲基化频率

    在表观遗传学的DNA甲基化研究中，新一代的测序方法可得到大量的全基因组甲基化特征数据，需要验证其中特定靶序列与表观遗传修饰的生理相关性。此验证过程较具挑战性，因为甲基化位点的位置和频率的微小改变也会带来明显的变化。焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是理想的验证方法。

       因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。

    技术优势：

♦ Pyrosequencing 能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域

♦ 启动子序列中接近的不同CpG岛的甲基化频率计算

♦ 适用于新鲜冷冻，和石蜡包埋的样本

♦ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现

♦ PCR反应之后，1个小时内可同时平行分析96个样本

五. LUMA法： 定量检测全基因组DNA甲基化水平，而不具体于特定的基因。

原理及方法如下：

基于在DNA甲基化分析中最常用的同裂酶对HpaII/MspI， Karimiet等人建立了全基因组DNA甲基化化学发光定量检测技术（Luminometric methylation assay, LUMA）.该检测方法以EcoRI作为内部参照。DNA将在两个独立酶切反应（MspI+EcoRI和HpaII+EcoRI）中消化。EcoRI酶切后在5’端留出-AATT-，而HpaII和MspI留出了-GC-序列。 然后采用焦磷酸测序平台上的聚合酶扩增技术填充核苷酸到5’端。最后用数学公式计算出HpaII/MspI位点甲基化水平即量化为全基因组甲基化的百分比。

结果计算方法如下：

上海希匹吉生物技术有限公司，是致力于生物医学相关技术服务的高科技公司。公司拥有现代化实验室和一流的实验设备（Eppendorf台式高速冷冻离心机, Heraeus、Sigma台式离心机， Life Technologies公司Veriti梯度PCR仪、GeneAmp 9700 PCR仪、StepOne Plus荧光定量PCR仪、ViiA 7荧光定量PCR仪、微流体芯片模块、QuantStudio 3D数字PCR系统、Qubit核酸定量仪，QIAGEN公司PyroMarkQ96ID焦磷酸测序平台等）。主要参与承担医院、科研院所的研究项目及生物医药企业的产品研发,服务对象覆盖大学,研究所,医院及生物医药企业. 服务内容包括: 基因表达检测(Mrna、MicroRNA) ; LncRNA检测； SNP检测; 拷贝数变异检测；基因甲基化检测；焦磷酸测序（Pyrosequencing); 数字PCR等。

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