设计和优化多重 PCR 引物，扩增目标区域，不同样本加上不同 index 区分，利用高通量测序平台进行深度测序，鉴定目标区域中的多态或突变位点。

优点：

1、自主引物设计及优化平台，保证测序结果特异性及均一性；

2、针对研究目标，灵活定制研究方案，测序有效覆盖度 95% 以上，准确率 >98%。

KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR），即竞争性等位基因特异性 PCR。KASP 反应包括 Primer Mix 和 Master Mix 两种主要成分。Primer Mix 由两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成，两条正向引物 5’端分别连有不同序列的检测引物序列。Master Mix 包含两条带有不同荧光的检测引物。

优点：

1、优异的准确性（独立评价的准确性 >99.8%）；

2、超强的灵活性；

3、前所未有的低成本（无需昂贵的双色标记探针）；

4、高效的成熟技术。

Fluidigm 的核心技术是微流控阀门技术，Biomark HD 系统是一种可进行基因分型、基因表达 profling、实时数字定量 PCR (qdPCR) 和单细胞分析的多用途实时 PCR 系统。Fluidigm BioMark 有三种芯片：96*96，48*48 和 192*24。

优点：

1、高通量，成本低；

2、灵敏度高，位点特异性探针，荧光标记的延伸引物，与 Taqman 金标准吻合度高；

3、时间短，从样本处理到拿到数据 3 - 4 个小时；

4、灵活性，任意物种，只要知道目的序列，探针可以定制。

通过 PCR 将覆盖 SNP 位点的 DNA 序列扩增出来，然后应用单一延伸引物（extension primer) 扩增 PCR 产物，然后用飞行质谱进行分析，根据差别进行分型。

优点：

1、高性价比，在所有的 SNP 分型方法中，价格低；

2、高准确性，采用尖端的飞行质谱的分型技术，比 RT-PCR 技术更精准；

3、高通量，一张芯片可对 384 个样本进行多重检测，每个体系多的实现 36 重反应；

4、广泛性，可测试各种类型的样本；

5、高效性，全自动分析数据，快的一天内可以完成基因分型报告。

第一代 DNA 测序技术（又称 Sanger 测序）在 1975 年，由 Sanger 等人开创，并在 1977 年完成第一个基因组序列（噬菌体 X174），全长 5375 个碱基。2001 年完成的人类基因组图谱就是利用了改进的 Sanger 法。SNP 分型检测的金标准，既能检测已知 SNP，也能发现未知 SNP。但是流程相对复杂，成本较高，工作量大，周期长，不适合大样本、多位点检测。

优点：

准确度高、操作简便、周期短。

缺点：

一代测序技术难以胜任微量 DNA 样品及大量样本和位点的测序。

适用范围：

位点明确、个数少、样本量少的验证及检测。