ChIP(Chromatin immunoprecipitation) 染色质免疫共沉淀

染色质免疫共沉淀技术主要应用于验证及探寻体内环境中，蛋白质和DNA的直接相互作用，旨在探索特定蛋白质在DNA上的特定结合序列，常在研究转录调控以及组蛋白修饰中被应用到。
实验过程大致为：交联-解交联-超声打碎-免疫沉淀-洗涤-DNA纯化-PCR检测。
 
具体操作：
样品准备：培养细胞(若样品为组织，可先培养原代细胞)；固定，或者直接活细胞送样。
 
细胞固定：此步骤目的为将结合在DNA上的蛋白用共价形式交联在所结合的位点上，避免在之后的操作步骤中脱离丢失。直接将甲醛加入细胞培养液，摇晃固定10分钟后，迅速加入2.5M甘氨酸解交联5分钟，PBS洗涤，刮下细胞。
 
超声打碎：此步骤目的为将长链的DNA打碎成200-1000bp的DNA片段。使用设备是超声水浴锅，EP管在冰水混合物中超声，超声后细胞悬液变得澄清透明。离心取上清。
 
免疫沉淀：此步骤是加入特异性抗体和对照IgG，和结合抗体的磁珠（或protein A/G）。经稀释后，超声产物分成两份，分别加入特异性抗体和对照IgG，轮转过夜，第二天加入磁珠轮转4小时。
 
洗涤：此步骤是减少非特异性结合。分别用稀释缓冲液、低盐溶液、高盐溶液、氯化锂溶液以及TE缓冲液洗涤共7次。用洗脱缓冲液在65℃洗脱过夜。
 
DNA纯化：将洗脱的产物用DNA纯化试剂盒纯化，得到50ul纯化产物，用于检测ChIP结果。

ChIP 以后一般做两种实验:ChIP-PCR和ChIP-seq
一：ChIP-PCR

ChIP-PCR是用来研究ChIP的这个转录因子和预测的某个基因的启动子是存在结合，集合的区域是哪一段。首先根据预测基因ORF区域上游2000-3000bp范围分段设计引物，一般每300bp设计一套，共合成8-10套引物。将每个样本ChIP以后的Input；IgG；IP三个样本分别用十个引物进行半定量ＰＣＲ的筛选，如果IP组的样本某套引物能P出条带，说明转录因子和预测基因启动子区域的这段序列存在结合。
qPCR定量富集倍数：将半定量电泳PCR筛选出来的有结合的引物，再用Input和IP样本进行QPCR验证，可算出ChIP富集的倍数。


二：ChIP-seq
HiSeq 2000,2x100 测序。 高通量测序

1.DNA质量控制
2.制备文库，质量控制
3.测序

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